淇河鯽TLR5-TLR22及信號通路關鍵基因克隆、表達分析及功能研究.pdf

1、魚類作為低等脊椎動物，其特異性免疫尚不完善，非特異性免疫在魚類對外界刺激及病原微生物侵襲的防御反應中起著至關重要的作用。Toll樣受體是非特異性免疫中一類重要的模式識別受體，能特異性地識別病原相關分子模式，通過細胞內信號通路的傳遞，進一步引發(fā)細胞的免疫應答，在魚類免疫中發(fā)揮重要作用。淇河鯽（Qihe crucian carp，Carassius auratus）是河南特有的天然三倍體魚類。近年來，隨著淇河鯽養(yǎng)殖范圍擴大，養(yǎng)殖密度增加，魚

2、類免疫力下降，疾病逐漸增多，從而給漁業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。因此，弄清病原菌感染后淇河鯽模式識別受體免疫應答機制，對于理解淇河鯽免疫應答和疾病防控具有重要的理論意義和應用價值。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性傳染病最主要的病原菌之一，常引起淇河鯽細菌性出血病，嚴重制約著淇河鯽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。目前，淇河鯽感染嗜水氣單胞菌后免疫反應的研究主要集中于生化指標測定和免疫基因表達變化，對淇河鯽模式識別受體免

3、疫應答機制缺少系統(tǒng)研究。
　　本論文以淇河鯽為研究對象，首先克隆其13種TLRs的部分片段，實時熒光定量PCR檢測嗜水氣單胞菌攻毒后TLRs在脾臟和頭腎中的表達變化，篩選出上調表達最為明顯的TLR5和TLR22;然后對TLR5和TLR22及信號通路下游關鍵元件MyD88和TRAF6進行克隆，從而獲得cDNA及基因組DNA全長序列，運用生物信息學方法進行結構預測及同源性分析;實時熒光定量PCR檢測胚胎發(fā)育不同時期基因的表達變化、淇河

4、鯽不同組織器官中的基因表達以及攻毒后各基因的表達響應。通過對基因進行原核表達，制備多克隆抗體，以研究蛋白表達;通過構建真核表達載體，轉染HEK293T細胞系，檢測相應分子的亞細胞定位及基因過表達后對下游NF-κB活性的調控作用。取得主要結果如下:
　　(1)以淇河鯽脾臟cDNA為模板，利用簡并引物進行PCR擴增，得到13種TLRs(分別為TLR1、2、3、4、5、7、8、9、18、19、20、21和22)的部分片段。實時熒光定量P

5、CR檢測嗜水氣單胞菌攻毒后不同時間(3、6、12、24和48 h)脾臟和頭腎中13種TLRs的表達變化，結果顯示TLR5和TLR22的表達上調最為明顯，最高值分別達到了對照組的52.56倍和28.14倍，表明二者在淇河鯽防御嗜水氣單胞菌感染的免疫應答中發(fā)揮重要作用，可能是淇河鯽識別嗜水氣單胞菌的主要受體。同時，這也是對淡水魚感染革蘭氏陰性細菌后所有已知Toll樣受體表達模式的首次研究。
　　(2)克隆得到淇河鯽TLR5、TLR2、

6、MyD88和TRAF6 cDNA及基因組DNA全長序列。①TLR5 cDNA序列全長2972 bp，包含5'-UTR140 bp、開放閱讀框2649 bp和3'-UTR183 bp，編碼882個氨基酸;預測蛋白相對分子量為101.5 kD，理論等電點為5.33;含有1個信號肽、13個LRR基序、1個LRR-CT基序、1個跨膜區(qū)和1個TIR結構域;DNA序列含有一個長度為223 bp的內含子，位于5'-UTR。②TLR22 cDNA序列全

7、長3613 bp，包含5'-UTR228 bp、開放閱讀框2838 bp和3'-UTR547 bp，編碼945個氨基酸;預測蛋白相對分子量為108.4kD，理論等電點為8.65;含有1個信號肽、15個LRR基序、1個LRR-CT基序、1個跨膜區(qū)和1個TIR結構域;DNA序列中沒有內含子。③yD88 cDNA序列全長2463bp，包含5'-UTR191 bp、開放閱讀框855bp和3'-UTR1417bp，編碼284個氨基酸;預測蛋白相對

8、分子量為33.1 kD，理論等電點為5.53;含有1個DEATH結構域和1個TIR結構域;DNA序列由5個外顯子和4個內含子組成。④TRAF6 cDNA序列全長2555 bp，包含5'-UTR52bp、開放閱讀框1632 bp和3'-UTR871 bp，編碼543個氨基酸;預測蛋白相對分子量為61.7 kD，理論等電點為5.81;其蛋白質由5個結構域組成，分別是1個RING結構域、2個Zf-TRAF結構域、1個CCR結構域和1個MATH

9、結構域;DNA序列由6個外顯子和5個內含子組成。⑤對不同魚類中氨基酸全長序列進行同源性分析，結果表明TLR5、TLR22、MyD88和TRAF6在魚類中高度保守，推測其在魚類中扮演重要的生物學功能。
　　(3)淇河鯽TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在個體發(fā)育早期階段廣泛表達，說明在淇河鯽胚胎及仔魚發(fā)育的整個過程中起著重要的免疫保護作用。受精卵中表達量較高，均屬于母源性基因，隨著受精卵的發(fā)育，對母源性基因mRNA的消耗，胚

10、胎中基因表達量逐漸降低，分別在原腸胚期（TLR5）、尾芽期（TLR22）、出膜期（MyD88和TRAF6）達到最低值，胚胎出膜后基因表達量明顯增加。這一研究結果提示:在魚類受精卵發(fā)育過程中，出膜前是免疫水平和抗病能力最薄弱階段，需加強照管，防止病原菌侵染魚類胚胎。
　　(4)淇河鯽TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在不同組織器官中呈組成型表達，但其mRNA表達水平具有明顯的組織特異性。①TLR5在腎臟中表達量最高，其次是肝

11、臟、頭腎、心臟和肌肉，鰓中表達量最低。②TLR22在頭腎中表達量最高，其次是腎臟、肌肉、肝臟和腸道;心臟和腦中表達量偏低。③MyD88在脾臟中表達量最高，肝臟、血液、肌肉、頭腎、腎臟和鰓次之，皮膚中表達量最低。④TRAF6在肌肉中表達量最高，血液次之，脾臟、腎臟、頭腎、皮膚和腸道中表達水平差異不顯著，鰓中表達量偏低。
　　(5) PolyI:C、鞭毛蛋白和嗜水氣單胞菌攻毒后淇河鯽TLR5和TLR22及其信號通路關鍵分子均表現(xiàn)出明顯

12、的表達響應，充分顯示了細菌感染后TLRs及信號通路關鍵元件在淇河鯽免疫應答反應中發(fā)揮重要作用。攻毒后淇河鯽TLR5和TLR22的表達峰值多出現(xiàn)在早期(3-12 h)，MyD88表達峰值多出現(xiàn)在處理后24 h，說明信號通路上不同元件的表達響應存在時間差異。攻毒后淇河鯽促炎細胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的表達普遍上調，其中IL-1β的表達量特別高，說明其在魚類免疫中發(fā)揮重要作用。
　　(6)利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化了淇河

13、鯽TLR5、TLR22和TRAF6部分片段以及MyD88全長的融合蛋白，分別用純化蛋白免疫小鼠，成功制備相應多克隆抗體，為進一步通過標記蛋白質進行相關研究奠定基礎。
　　(7)構建GFP標記的真核表達重組載體，然后轉染HEK293T細胞系，激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細胞定位，結果顯示TLR5/22-TIR結構域融合蛋白主要分布在細胞質中靠近細胞膜的位置，這預示著淇河鯽TLR5/22全長分子可能位于細胞膜上;MyD88和TRA

14、F6則位于細胞質中。
　　(8)目的片段與pcDNA3.1連接構建真核表達重組載體，分別與NF-κB熒光素酶報告基因載體共轉染HEK293T細胞系，利用雙熒光素酶報告基因檢測法測定目的基因過表達對NF-κB活性的影響，結果顯示過表達TLR5-TIR結構域、TLR22-TIR結構域和MyD88均能顯著增加NF-κB的活性，表明三者在哺乳動物細胞中能正常行使其信號轉導功能，激活下游信號通路;但過表達TRAF6對NF-κB的活性沒有明顯