亞油酸異構酶基因的克隆、表達及其功能鑒定.pdf

1、共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacid，CLA)是亞油酸(linoleicacid，LA)具有共軛雙鍵的所有位置和幾何異構體的統(tǒng)稱。其中，9-cis,11-trans-CLA和10-trans,12-cis-CLA等異構體具有抗癌等重要生理功能。目前，CLA的工業(yè)化制備主要是化學法生產(chǎn)，產(chǎn)物是CLA多種異構體的混合物，這不利于其在食品和醫(yī)藥方面的廣泛應用。自然界中一些細菌具有將LA轉化為CLA的能力，細菌體內(nèi)酶的作用具

2、有更高的專一性和轉化效率，有很好的應用前景。 本論文從一株高產(chǎn)CLA的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)lp-18出發(fā)，通過比對分析已知的細菌體內(nèi)亞油酸異構酶的序列，利用PCR和IPCR技術，得到L.plantarumlp-18基因組中2116bp的DNA片段，含有一個完整的ORF，即為推定的亞油酸異構酶基因(pli18)。pli18序列全長1710bp。 將pli18基因克隆入pET30a原核表

3、達載體中，轉化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)重組表達。經(jīng)過優(yōu)化表達條件，在含1％葡萄糖LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，18℃，0.1mMIPTG誘導，搖床培養(yǎng)20h實現(xiàn)重組蛋白PLI18最優(yōu)化表達。通過Ni離子親和層析一步純化得到PLI18純酶。PLI18分子量約68kDa。 使用純化的PLI18進行了酶活鑒定實驗，純酶比活達到285U/mg.對酶活反應產(chǎn)物進行萃取、甲酯化和氣相色譜檢測，結果證實PLI18將LA底物轉化為9-ci