番茄SlSGR1和SlNIP7基因的功能研究.pdf

1、果實成熟是一個高度程序化的生物過程，涉及到色素代謝、風(fēng)味形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面，大量的基因參與了這一過程。通過前期的研究，我們在番茄（Solanum lycopersicum）中克隆得到了兩個可能與果實成熟有關(guān)的基因——SlSGR1基因和SlNIP7基因。SlSGR1基因是我們從番茄滯綠突變體green flesh（gf）中分離得到的，其在gf中發(fā)生了單核苷酸突變。因其與水稻（Oryza sativa）SGR基因高度同源，故命名為Sl

2、SGR1基因。前期的Northern Blot結(jié)果表明SlSGR1基因的表達與果實成熟和葉片衰老特異相關(guān)，并受環(huán)境脅迫和乙烯信號的誘導(dǎo)。為了進一步闡明gf的突變機理和SlSGR1基因的生理功能，我們通過構(gòu)建RNAi沉默載體以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因，獲得了16株NPTII陽性轉(zhuǎn)基因番茄苗系。半定量RT-PCR結(jié)果表明其中有5株達到了對SlSGR1基因較好的沉默效果。這5株番茄苗系均表現(xiàn)出與gf一致的滯綠表型，衰老和黑暗處理均不能誘導(dǎo)其葉

3、片的黃化?？?cè)~綠素的提取與測定結(jié)果表明，SlSGR1基因的沉默阻斷了葉綠素的正常降解過程。綜合上述實驗結(jié)果，我們認為gf中SlSGR1蛋白的錯義突變很可能是導(dǎo)致其滯綠表型的根本原因，而有功能的SlSGR1蛋白很可能是葉綠素正常降解所必需的。由于SlSGR1基因是一個與果實成熟和葉片衰老都特異相關(guān)的基因，我們通過5’端缺失技術(shù)和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了994bp、737bp、529bp、328bp以及152bpSlSGR1啟動子驅(qū)動的GUS報

4、告基因轉(zhuǎn)基因番茄苗系。然而半定量RT-PCR和GUS活性檢測結(jié)果表明，最長的994bp SlSGR1啟動子片段還不足以實現(xiàn)對GUS報告基因的正常調(diào)控。這說明SlSGR1啟動子與衰老和成熟相關(guān)的核心元件可能還位于-994bp的上游。
　　SlNIP7（NR interaction protein 7）是我們通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選得到的可能與成熟特異相關(guān)乙烯受體SlETR3（NR）互作的蛋白質(zhì)。其編碼基因CDS區(qū)全長234bp，編碼

5、77個氨基酸殘基。定量Real-time RT-PCR結(jié)果表明，SlNIP7基因在番茄的各個器官和各個發(fā)育時期均有一定的表達，但表達量以花器官居高。此外，SlNIP7基因的表達在果實成熟后期有顯著上調(diào)，但這種上調(diào)趨勢在乙烯不敏感突變體Nr（Never ripe）和果實不成熟突變體rin（ripening inhibitor）中受到了明顯的抑制。與果實成熟過程中的上調(diào)趨勢不同，SlNIP7基因的表達隨葉片的衰老進程而下調(diào)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的對野

6、生型番茄SlNIP7基因的超表達和沉默并沒有影響成熟果實的外在表型以及相關(guān)Marker基因（PSY1、PG、TomLoxB、ACO3、ACS2、E4、E8以及ERF1）的表達水平。這表明SlNIP7蛋白很可能并不參與乙烯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而更可能受到了乙烯信號的調(diào)控，這種調(diào)控的生理學(xué)意義可能在果實成熟范疇之外。接下來的抗性實驗表明，SlNIP7沉默轉(zhuǎn)基因苗系在干燥環(huán)境下較野生型有著更好的生長狀況。這暗示SlNIP7基因的表達水平可能與植株對干

7、燥的抗性有關(guān)。轉(zhuǎn)基因苗系在生理和分子水平的諸多表現(xiàn)使我們萌生對SlNIP7-NR互作關(guān)系的質(zhì)疑，全新的酵母雙雜交實驗肯定我們對互作關(guān)系假陽性的猜想。然而，基于SlNIP7沉默轉(zhuǎn)基因苗系對干燥環(huán)境的較好抗性，進一步深入研究SlNIP7基因的功能還是有一定意義的，而對于其命名還有待商榷。
　　此外，在我們的轉(zhuǎn)基因后代中，有兩個株系表現(xiàn)出純合狀態(tài)下的卡那霉素敏感性以及雜合狀態(tài)下的卡那霉素抗性。Northern Blot表明，NPTII標(biāo)

8、記基因在純合后代中受到了沉默，而在雜合后代中能夠正常表達。因此，我們將這一現(xiàn)象命名為純合子依賴型協(xié)同抑制。small RNA檢測結(jié)果表明，NPTII同源small RNA廣泛存在于轉(zhuǎn)基因后代中，但其在純合后代中的豐度要明顯高于雜合后代。為了闡明small RNA產(chǎn)生的分子機制，我們檢測了轉(zhuǎn)基因植物中的通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（read-through transcripts），結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有CaMV35S啟動子驅(qū)動下的含反義NPTII片段的通讀RNA

9、存在于轉(zhuǎn)基因植物中。結(jié)合這一實驗結(jié)果，我們推測：通讀RNA很可能與正義NPTII mRNA配對形成擁有部分雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA，并在Dicer酶的作用下水解為siRNA；如果植株是在雜合狀態(tài)，通讀RNA不能達到閥值水平，只有少量的dsRNA和siRNAs形成；如果植株是在純合狀態(tài)，通讀RNA會超過閥值水平并有效形成大量的dsRNA和siRNAs；這些siRNAs隨后作為信號分子介導(dǎo)了NPTII基因mRNA的降解，并最終導(dǎo)致了NPTII基