麗蠅嗅覺共同受體Orco的克隆、鑒定及其功能研究.pdf

1、背景
　　昆蟲高度復雜而靈敏的嗅覺系統(tǒng)用于識別環(huán)境中特異的化學氣味分子。嗅覺在昆蟲的覓食、寄主定位、尋偶、產卵等方面發(fā)揮著重要的生物學作用。對嗅覺分子機制的研究揭示了氣味受體介導的氣味分子與嗅覺神經元的專一性結合是昆蟲嗅覺信號轉導的重要生理學基礎。每個昆蟲嗅覺神經元通常表達兩種氣味受體:傳統(tǒng)氣味受體和嗅覺共同受體Orco（之前被稱為Or83b）。每種昆蟲只有一種Orco受體基因，且都為果蠅Orco的直系同源基因(ortholog)

2、。各種昆蟲的Orco組成了Orco受體家族（Orco family）。Orco通過異源二聚化與傳統(tǒng)氣味受體形成一個具有氣味識別能力的復合體。Orco受體的主要功能是將傳統(tǒng)氣味受體運送至嗅覺神經元樹突膜的表面，同時維持嗅覺受體復合體的構象穩(wěn)定。對該受體基因的突變可以導致昆蟲嗅覺功能的嚴重缺失。因此，有望以Orco受體作為潛在的分子靶標設計和發(fā)展新的害蟲治理策略。
　　絲光綠蠅Lucilia sericata Meigen和大頭金蠅C

3、hrysomyamegacephala Fabricius，屬于雙翅目Diptera麗蠅科Calliphoridae，是兩種重要的醫(yī)學媒介昆蟲。成蟲能機械性傳播多種病原體，危害人類健康。幼蟲作為兼性體外寄生蟲可以引起蠅蛆病，對畜牧業(yè)造成較大的經濟損失。對于麗蠅嗅覺系統(tǒng)的研究先前主要集中在形態(tài)學、電生理學、行為學和化學生態(tài)學等方面，尚未開展有關嗅覺分子機制的研究。
　　目的
　　探究麗蠅嗅覺識別的分子基礎，克隆氣味受體基因并鑒

4、定其功能，為更有效的利用嗅覺系統(tǒng)進行麗蠅綜合治理提供理論依據和實踐指導。
　　方法
　　1.采用RT-PCR方法和RACE策略克隆絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長序列。利用多種生物信息學軟件分析新獲得基因的核酸序列，預測其推導氨基酸序列的結構特征。
　　2.使用半定量RT-PCR方法檢測絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因在成蟲觸角、下顎須、胸部、腹部、足部及產卵器中的表達情況。
　　3.應用原位雜交技術檢測大頭金

5、蠅Orco基因的mRNA在觸角和下顎須中的分布情況。
　　4.采用熒光定量PCR方法檢測絲光綠蠅Orco基因在卵、幼蟲、蛹及成蟲四個發(fā)育階段的相對表達水平。
　　5.為鑒定麗蠅Orco基因的功能，利用RNA干擾技術沉默大頭金蠅Orco基因的表達，通過Y型嗅覺儀驗證大頭金蠅對食物氣味趨化性行為反應。
　　結果
　　1.克隆得到絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長序列，分別命名為LserOrco（GenBank登錄號

6、:HQ315862）和CmegOrco（GenBank登錄號:HQ315861）。LserOrco和CmegOrco的開放讀碼框都為1437bp，編碼478個氨基酸殘基。兩條基因推導的蛋白序列不僅彼此間具有98％的同一性，并且與先前報道的其他昆蟲的同源受體之間具有高度的序列保守性。組成蛋白C末端的164個氨基酸為序列的極端保守區(qū)，氨基酸的同一性接近90％。LserOrco和CmegOrco的蛋白序列被預測都包含7個跨膜區(qū)，膜拓撲結構與其

7、他昆蟲Orco蛋白相同，跨膜方式為受體蛋白的N末端位于膜內C末端位于膜外。
　　2.LserOrco和CmegOrco在雌性和雄性的觸角及下顎須中呈強表達，在雌性的產卵器中存在微弱表達;在其他非嗅覺組織中表達模式有所差別，LserOrco在雌性和雄性的足部有少量表達，在胸部和腹部無表達，而CmegOrco在雌性和雄性的腹部有少量表達，在胸部和足部無表達。
　　3.CmegOrco基因的mRNA在雌性和雄性的大部分嗅覺神經元中

8、都有表達。在觸角第3節(jié)（鞭節(jié)）和下顎須的末端膨大處被探針標記的陽性嗅覺神經元呈廣泛性分布，而在觸角第1節(jié)（柄節(jié)）呈零星分布。
　　4.LserOrco在卵、幼蟲及成蟲三個階段都有表達，而在蛹的早期（蛹殼形成后36 hr左右）未見到表達。卵期相對表達量最低。在幼蟲期，LserOrco的相對表達量從1齡期到2齡期逐漸增加，到3齡期開始下降。LserOrco在成蟲嗅覺組織的表達水平遠遠高于卵和幼蟲階段的組織。其中，LserOrco在雌蠅

9、觸角中的相對表達量是卵的413倍。
　　5.對CmegOrco基因實施RNA干擾后的24 hr、48 hr和72 hr，使用RT-PCR對dsRNA注射組、無RNase水注射組與未注射組CmegOrco基因的mRNA進行檢測。結果顯示，與無RNase水注射組和未注射組相比，dsRNA注射組CmegOrco基因的表達量在48 hr和72 hr明顯降低，說明隨著時間增加，dsRNA對嗅覺器官中CmegOrco基因的表達起到了明顯的抑制

10、作用。無RNase水注射組與未注射組CmegOrco轉錄本的條帶強度十分接近，說明無RNase水對CmegOrco基因表達沒有影響。行為學實驗顯示，在假設大頭金蠅對食物源和對照品的選擇率相等（即H0）的前提下，未注射組（野生型）成蟲被腐敗豬肝產生的氣味強烈吸引(x2=16.634，df=1，p=0.000);同樣，注射無RNase水的成蟲對腐敗豬肝產生的氣味具有顯著的趨向性(x2=12.281，df=1，p=0.000)。然而，注射ds

11、RNA的成蟲對食物氣味的敏感性明顯減弱，在腐敗豬肝與對照品的選擇上呈隨機分布(x2=0.048，df=1，p=0.827)，接受Ho，表明dsRNA沉默了CmegOrco基因的表達，從而顯著損害了大頭金蠅的嗅覺能力。
　　結論
　　1.首次從兩種媒介昆蟲絲光綠蠅和大頭金蠅中克隆出氣味受體基因。
　　2.LserOrco和CmegOrco是果蠅Orco的直系同源基因，與Orco家族中的其他成員具有極為相似的結構特征和表達