T-2毒素抑制GH3細胞生長激素合成與分泌的基因組和蛋白組研究.pdf

1、T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物，是這類毒素中毒性最強的一種，是污染飼料的主要的霉菌毒素，對人、畜禽健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的危害。急性暴露單端孢毒素可導(dǎo)致嘔吐和腹瀉，長期暴露可致機體厭食，抑制生長，造成內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等損傷嚴重。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-2毒素的靶器官之一是動物的腦垂體，實驗室前期研究表明，T-2毒素可以抑制大鼠垂體瘤GH3細胞生長激素的分泌，生長激素對于脊椎動物的生長調(diào)控起重要作用。目前，T-2毒素對動物生長抑制機

2、制的研究并不深入，其影響生長激素的合成和分泌機制并未得到很好的揭示?，F(xiàn)今，基因組和蛋白組學(xué)技術(shù)已成為研究毒理作用機理和尋找靶點的新手段。鑒于T-2毒素抑制生長毒性的重要性，本研究選擇中低劑量(10nM和40 nM)的T-2毒素暴露大鼠垂體瘤GH3細胞為實驗材料，運用安捷倫大鼠44 K基因芯片和雙向電泳-質(zhì)譜鑒定技術(shù)相結(jié)合，篩選T-2毒素作用于GH3細胞后的差異基因和差異蛋白，分析與抑制生長毒性作用相關(guān)的基因、蛋白及抑制生長激素合成與分泌

3、的分子機制。為今后國內(nèi)外T-2毒素的研究提供參考，進而為食品安全和控制靶點提供科學(xué)依據(jù)。
　　 1.毒素的選擇和毒素作用時間和濃度的確定
　　 文獻及實驗室前期研究表明，T-2毒素是單端孢毒素中毒性最強的，因此本研究只需比較T-2毒素和代謝產(chǎn)物的毒性大小。采用MTT實驗檢測T-2毒素及代謝物(5-80nM)作用于GH3細胞株12h后細胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-2毒素抑制GH3細胞活力的毒性最強，并表現(xiàn)出濃度依賴性的毒性

4、效應(yīng)，因此選擇T-2毒素作為后續(xù)實驗的化合物，對于探討單端孢毒素的生長毒性機制研究更有意義。
　　 為了確定與毒素作用直接相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)以及毒素濃度與基因變化之間的劑量關(guān)系，本研究使用ELISA方法檢測T-2毒素(5-80 nM)作用于GH3細胞12 h后生長激素的合成與分泌量。結(jié)果表明，T-2毒素能顯著抑制GH的合成和分泌并呈現(xiàn)濃度依賴性，10nM和40 nM T-2毒素抑制生長激素的結(jié)果:GH分泌分別為90.45％±4.

5、32和88.67％±3.57，GH合成分別為185.23％±3.47和170.17％±2.1，統(tǒng)計學(xué)分析呈差異顯著。在不影響細胞活力且能抑制生長激素的合成和分泌前提下，最終確定的作用時間為12h，作用濃度為10 nM和40 nM。
　　 2.T-2毒素作用GH3細胞后的差異表達基因
　　 為了研究T-2毒素抑制GH合成與分泌的分子機制，按照上述結(jié)果及相關(guān)文獻，選擇10nM和40 nM的T-2毒素處理GH3細胞12h作為兩

6、個不同的毒素處理組，未處理的GH3細胞作為空白對照組，利用安捷倫芯片篩選毒素作用后的差異基因，并對差異基因進行功能分類。
　　 基因芯片結(jié)果顯示10nM T-2毒素組與空白組相比有1044個下調(diào)差異基因（已知名稱和功能的基因有877個），1408個上調(diào)差異基因（已知名稱和功能的基因有1261個）;40 nM T-2毒素組與空白組相比有1610個下調(diào)差異基因（已知名稱和功能的基因有1194個），1736個上調(diào)差異基因（已知名稱和功

7、能的基因有1541個），呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)明確。這些差異基因涉及能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)運、氧化還原等多個生物學(xué)過程。分析相關(guān)基因的功能，推測半胱氨酰-tRNA合酶、天冬氨酰-tRNA合酶及核糖體應(yīng)激信號通路可能是T-2毒素抑制GH合成的重要分子靶點。另外，T-2毒素下調(diào)與能量代謝相關(guān)的基因，干擾細胞內(nèi)的能量代謝，造成生長激素合成和分泌過程中能量不足，進而造成生長激素的含量降低。用熒光定量PCR驗證了基因Ergic2、Nqo1、

8、Snap25、HCK、PKR和caspase3，結(jié)果表明上述基因mRNA表達與芯片變化趨勢一致，說明這些基因可能參與了T-2毒素影響生長激素分泌合成的過程。
　　 3.T-2毒素作用GH3細胞后的差異表達蛋白
　　 為了從蛋白水平同步探究T-2毒素抑制生長激素合成和分泌的機制，運用雙向電泳-質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的技術(shù)，研究T-2毒素暴露大鼠垂體瘤細胞12h、24 h的蛋白表達譜變化，采用MALDI-TOF MS/MS生物質(zhì)譜技

9、術(shù)進行鑒定，成功鑒定的蛋白:T-2處理GH3細胞12 h有91個差異蛋白，30個上調(diào)蛋白和61個下調(diào)蛋白;24h共鑒定63個差異蛋白，上調(diào)蛋白25個和下調(diào)蛋白38個。采用Gene Ontology、KEGG等生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能。大量能量代謝中的酶類表達水平發(fā)生改變，如丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等，揭示T-2毒素影響了GH3細胞內(nèi)正常的能量代謝過程，進而影響

10、GH的合成與分泌過程。二硫鍵異構(gòu)酶在GH的合成過程中起關(guān)鍵作用，T-2毒素作用后其表達下調(diào)，直接影響GH的合成。另外，細胞骨架蛋白(Coficin-1、TBA1C、Actin)、鈣調(diào)蛋白和氧化還原蛋白等其他蛋白可能協(xié)同影響T-2毒素抑制GH的合成與分泌過程。生長激素作為本研究的目的蛋白，GRP78蛋白幫助GH的正確折疊，在T-2毒素作用后變化顯著，因此本研究采用Western blot方法驗證了GH和GRP78蛋白的表達，結(jié)果與雙向電泳

11、結(jié)果一致。
　　 基于基因和蛋白的整體分析，T-2毒素抑制生長激素合成分泌的毒性機制可能是:正常的GH3細胞具有分泌功能且蛋白質(zhì)合成旺盛，T-2毒素作用于GH3細胞后激活PKR和HCK激酶，誘發(fā)核糖體應(yīng)激反應(yīng)，激活JNK通路，導(dǎo)致凋亡反應(yīng)的發(fā)生。同時發(fā)現(xiàn)氨酰-tRNA合酶降低、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)表達下調(diào)，從而抑制GH的合成。T-2毒素激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激晚期反應(yīng)，新發(fā)現(xiàn)的ER的感受器Creb311基因下調(diào)表達，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋