褪黑素對熱應激豬卵母細胞體外成熟的影響.pdf

1、本試驗的目的是研究熱應激對豬卵母細胞體外成熟的影響，以及在成熟培養(yǎng)基中添加褪黑素對熱應激豬卵母細胞體外成熟的作用。以豬卵巢中分離出的GV期COCs為研究對象，通過體外41℃生理熱應激4h后成熟至MⅡ期，對卵母細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)、胞質(zhì)中線粒體分布情況、線粒體染色熒光強度、核編碼線粒體相關(guān)基因和線粒體編碼基因的表達進行檢測，以及觀察孤雌激活后胚胎的發(fā)育情況。
　　將豬卵母細胞按對照組（C組）、正常培養(yǎng)加10-9M褪黑素組(C+M

2、(-9)組）、正常培養(yǎng)加10-8M褪黑素組(C+M(-8)組）、熱應激組（H組）、熱應激加10-9M褪黑素組(H+M(-9)組）、熱應激加10-8M褪黑素組(H+M(-8)組）隨機分成6組，體外成熟培養(yǎng)至MⅡ期，孤雌激活后觀察胚胎發(fā)育情況，試驗結(jié)果顯示:與C組相比，C+M(-8)組能夠顯著提高豬卵母細胞的囊胚發(fā)育率（P＜0.05）;在H組中，熱應激顯著的降低了囊胚發(fā)育率(P＜0.05)，熱應激培養(yǎng)基中添加褪黑素能夠提高囊胚率（P＜0.0

3、5），但是H+M(-8)組能夠顯著的提高囊胚率(P＜0.05)而H+M(-9)組只有提高的趨勢但差異并不顯著（P＞0.05）。其中卵母細胞的卵裂率并不受不同處理的影響，各處理的卵裂率差異不顯著（P＞0.05）。
　　線粒體拷貝數(shù)可作為衡量卵母細胞成熟的重要指標之一，本試驗進一步研究熱應激對豬卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)的影響。同樣卵母細胞隨機分成六組，成熟培養(yǎng)至MⅡ期，利用RT-PCR方法對卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)進行量化，試驗結(jié)

4、果表明:與C組相比，C+M(-8)組顯著的提高了卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)（P＜0.05）;在熱應激的條件下，H組的mtDNA顯著降低(P＜0.05)，而H+M(-9)組和H+M(-8)組都能夠顯著的提高mtDNA拷貝數(shù)（P＜0.05）。這與孤雌胚胎發(fā)育的數(shù)據(jù)吻合，說明熱應激降低卵母細胞的發(fā)育潛能是通過減少胞質(zhì)中mtDNA拷貝數(shù)來影響卵母細胞胞質(zhì)的成熟。
　　在卵母細胞成熟過程中，線粒體的分布也隨成熟的過程發(fā)生移位。利用Mito-

5、Tracker染色觀察MⅡ期豬卵母細胞中線粒體的分布情況。與C組相比，H組中細胞胞質(zhì)中線粒體分布不均，出現(xiàn)空洞，而H+M(-8)組中，線粒體又恢復了正常的分布。這說明褪黑素也通過影響線粒體的分布來提高卵母細胞成熟的質(zhì)量。同時對Mito-Tracker染色熒光信號強度進行定量分析得出，與C組相比，褪黑素能夠顯著提高C+M(-8)組的熒光信號強度（P＜0.05）;而H組中，熱應激使得線粒體染色強度明顯降低（P＜0.05），而H+M(-8)組

6、又顯著提高了熒光信號強度(P＜0.05)。這說明褪黑素增加了卵母細胞中活性線粒體數(shù)量同時保持線粒體膜電位處于正常水平。
　　在豬卵母細胞中與mtDNA復制相關(guān)的核編碼基因的表達進行檢測得出:與C組相比，C+M(-8)組能夠顯著提高Tfb1m基因的表達(P＜0.05)。而H組中，Tfb1m、POLG2的表達顯著下降（P＜0.05），H+M(-8)組中Tfb1m、POLG2、POLG、Ssbp1的表達與H組相比都有顯著的提高（P＜0.

7、05）。這說明褪黑素是通過調(diào)節(jié)核編碼線粒體相關(guān)基因的表達影響mtDNA拷貝數(shù)，從而提高卵母細胞的質(zhì)量，以緩解熱應激對其損傷。
　　為進一步研究核編碼基因與線粒體編碼基因之間的關(guān)系，選取了線粒體基因ND2和ND6進行檢測，結(jié)果表明:與C組相比，C+M(-8)組顯著的提高了ND2和ND6基因的表達(P＜0.05)，熱應激顯著的降低了ND2和ND6基因的表達（P＜0.05），但在H組和H+M(-8)組并沒有顯著變化(P＞0.05)。綜上