血管內(nèi)皮生長因子對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響.pdf

1、目前，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)已取得很大進(jìn)展，但體外成熟得到的卵母細(xì)胞仍存在發(fā)育能力較差的問題。本研究旨在探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟及其后續(xù)胚胎發(fā)育的影響，并初步研究其相關(guān)作用機(jī)制，以期進(jìn)一步完善水牛體外成熟培養(yǎng)體系，提高體外胚胎生產(chǎn)效率。本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴探討了VEGF及其受體VEGFR1與VEGFR2在卵泡發(fā)育和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)體外成熟培養(yǎng)過程中的表達(dá)變化規(guī)律。VEGF在

2、卵巢組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期卵泡中均有VEGF表達(dá)，且主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)。水牛COCs中VEGF表達(dá)情況的免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，VEGF主要在卵丘細(xì)胞中表達(dá)，在卵母細(xì)胞不表達(dá)。水牛COCs在體外成熟過程中的VEGF及其受體表達(dá)變化實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF在成熟培養(yǎng)過程中(0h、6h、12 h與24 h)的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，其中VEGF在成熟前(0h)表達(dá)量顯著高于成熟6 h(P＜0.

3、05)，而成熟6h、12h與24 h間VEGF表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05);VEGFR1與VEGFR2在成熟過程中均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其中VEGFR1表達(dá)量在成熟6h時(shí)達(dá)到最高值，VEGFR2在成熟12h表達(dá)量達(dá)到最大。
　　 ⑵探討了不同濃度VEGF對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟及其后續(xù)胚胎發(fā)育的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在體外成熟培養(yǎng)中添加5 ng/ml的VEGF能顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率(34.81％ v

4、s43.73％，P＜0.05)及其后續(xù)體外受精和核移植胚胎的卵裂率(35.11％ vs44.81％;48.65％ vs86.27％，P＜0.05)與囊胚率(11.45％ vs20.18％，18.92％ vs31.69％，P＜0.05)，但VEGF對(duì)裸卵體外成熟無顯著影響(22.67％ vs18.18％，P＞0.05)。COCs體外成熟后卵丘細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加濃度為5 ng/ml的VEGF能顯著降低卵丘細(xì)胞凋亡率(P＜

5、0.05);體外成熟過程中COCs凋亡(bax、bcl2、birc4、caspase-3與fas)與發(fā)育(CX37、PTGS2、CX43、CYP11A1、CYP19A1、PCNA、CCNB、FSHR、MAPK、VEGFR1與VEGFR2)相關(guān)基因表達(dá)情況的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加濃度為5 ng/ml的VEGF能顯著提高卵丘細(xì)胞birc4、CX37、CYP11A1與PGES的mRNA水平（P＜0.05），顯著降低凋亡因子caspase

6、-3與fas的mRNA水平（P＜0.05），對(duì)bcl2、bax、CX43、CY19A1、PCNA、FSHR、MAPK、CCNB、PTGS2、VEGFR1與VEGFR2的mRNA表達(dá)無影響。
　　 ⑶上述結(jié)果表明：VEGF在水牛卵泡各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，且主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，在卵母細(xì)胞中不表達(dá)；內(nèi)源性的VEGF在水牛COCs體外成熟過程中呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而VEGFR1與VEGFR2均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；體外成熟培養(yǎng)液中添加5 n

7、g/ml的VEGF有利于提高水牛卵母細(xì)胞的成熟及其后續(xù)早期胚胎的發(fā)育能力，但對(duì)裸卵的成熟無影響；添加濃度為5ng/ml VEGF不但能抑制水牛COCs中卵丘細(xì)胞的凋亡，而且能促進(jìn)卵丘細(xì)胞birc4、CX37、CYP11A1與PGES的mRNA表達(dá)水平，降低caspase-3與fas的mRNA水平，但對(duì)bcl2、bax、CX43、CY19A1、PCNA、FSHR、MAPK、CCNB、PTGS2、VEGFR1與VEGFR2的mRNA表達(dá)無影