香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析.pdf

1、ARF3基因?qū)儆贏RF基因家族的成員，該基因比較保守，主要功能是控制細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究以巴西蕉為材料，分離克隆了ARF3基因cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了Cam35s-gfp-gus-ARF3表達(dá)載體，該載體同時(shí)含有綠色熒光蛋白和GUS報(bào)告基因，可以更準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將ARF3基因轉(zhuǎn)入煙草基因組中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)其功能進(jìn)行了分析和鑒定。得出的主要結(jié)果如下:

2、r>　　 1、香蕉RNA提取方法的優(yōu)化。在前人基礎(chǔ)上，對(duì)香蕉RNA提取方法作了改進(jìn)，優(yōu)化后的方法比較適用于香蕉不同器官RNA的提取，并且提取的RNA量度大、條帶清晰、無污染及完整性較好，可以較好滿足下游實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 2、香蕉ARF3基因cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析。利用RACE方法首次獲得了香蕉的ARF3基因cDNA全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)1427bp，編碼338個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為38.24KD，等電點(diǎn)為5.36

3、。開放閱讀框?yàn)?166bp，其中起始密碼子位于174 bp，終止密碼子位于1340 bp。香蕉ARF3基因核苷酸序列與其它植物ARF基因核苷酸序列具有69％-74％的相似性，氨基酸序列有81％-93％的相似性。
　　 3、ARF3基因在香蕉不同器官中表達(dá)特性分析。利用半定量RT-PCR方法分析其表達(dá)特性，結(jié)果表明:香蕉ARF3基因的表達(dá)量在葉片中最高，其次是根系，莖中的表達(dá)量最低。
　　 4、香蕉組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化。分別

4、采用香蕉雄花序、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和莖段橫切薄片三種外植體材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，經(jīng)過綜合比較得出的結(jié)果為:采用莖段橫切薄片繁殖無菌香蕉苗具有操作簡(jiǎn)單、外植體污染率低、培育周期短等優(yōu)點(diǎn)，可以較快繁殖出大量的香蕉組培苗，從而滿足實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 5、表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。利用載體Cam35s-gfp-gus上Sac I和BamH I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，將目的基因插入到多克隆位點(diǎn)區(qū)，從而完成載體的構(gòu)建。在遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化過程中，篩選

5、出卡那霉素的致死濃度為400 mg/L，半致死濃度為200 mg/L;抗性培養(yǎng)基中羧芐青霉素的濃度為500mg/L時(shí)可以很好地抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng);農(nóng)桿菌侵染時(shí)間在15 min，菌液濃度OD600值為0.8時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。
　　 6、轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)及功能分析。提取煙草的DNA和RNA，利用特異性引物擴(kuò)增對(duì)陽性植株進(jìn)行檢測(cè);利用GUS報(bào)告基因?qū)ο憬禔RF3基因在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);利用綠色熒光蛋白報(bào)告基因?qū)﹃栃灾仓赀M(jìn)行檢測(cè)。結(jié)