草魚三個C1q相關(guān)基因的克隆及表達分析.pdf

1、草魚是中國乃至世界最重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一,具有悠久的養(yǎng)殖歷史。但草魚養(yǎng)殖病害頻發(fā),草魚呼腸孤病毒所導致的草魚病毒性出血病給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失。迄今為止,有效預防這種傳染病仍然十分困難,傳統(tǒng)方法有其局限性。通過選育出抗病力強的草魚新品種,再結(jié)合已有的預防和治療方式來增強草魚抵抗疾病傳染的能力,不失為一條有效的路徑。補體系統(tǒng),作為先天性免疫中的一類重要和保守的體系,為機體提供了快速和高效地清除入侵微生物的途徑。C1q是補體經(jīng)典途徑的目

2、標識別蛋白,除能夠激活補體經(jīng)典途徑外,還具有參與機體免疫的多種功能。本研究克隆了草魚三個C1q相關(guān)基因, C1qB、C1qC以及C1q-like,分析了它們的理化性質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu),比較了它們的同源性,研究它們在草魚不同發(fā)育過程、不同組織及其受草魚呼腸孤病毒感染后的表達情況,取得了如下結(jié)果:
　　1.通過同源克隆方式得到草魚C1qB和C1qC基因中間片段,從本實驗室已構(gòu)建的草魚頭腎均一化文庫中獲得C1q-like基因部分cDNA片段

3、;進而采用RACE技術(shù)獲得這3個基因的cDNA全長序列,分別為939bp,916bp,1202bp;分別含有編碼243(729bp),244(732bp),248(744bp)個氨基酸的開放閱讀框,N端分別含有26,23,22個氨基酸信號肽序列。
　　2.BLAST分析發(fā)現(xiàn),草魚C1qB,C1qC和C1q-like都是較為保守的蛋白家族成員,草魚與斑馬魚的C1qB、C1qC氨基酸序列相似度最高,分別達到67％、71%;草魚C1q-

4、like與斑馬魚C1qtnf5氨基酸序列相似度最高;選取各自基因不同物種的氨基酸序列,通過MEGA5.0軟件,使用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)草魚與其它硬骨魚類的親緣關(guān)系最近,這些結(jié)果都支持了傳統(tǒng)的進化理論,反應了其實際的親緣關(guān)系。
　　3.多序列比對和蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),C1qB、C1qC基因都包含有三個保守的結(jié)構(gòu)域:N-端信號肽,膠原結(jié)構(gòu)域和C-端球狀結(jié)構(gòu)域,且其氨基酸序列中與鏈間及鏈內(nèi)的二硫鍵結(jié)合有關(guān)的四個半胱氨酸位點一

5、致,并在不同物種中高度保守。但他們的氨基酸序列一致度并不高,表明他們的功能可能具有一定差異性。C1q-like基因具有與補體C1q高度同源的C-端球狀結(jié)構(gòu)域和與TNF-α相似的THD結(jié)構(gòu)域兩大C1q/TNF家族成員重要結(jié)構(gòu)部分。
　　4.利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測健康草魚各組織及使用草魚呼腸孤病毒誘導后3個基因的表達譜,結(jié)果顯示:3個基因在所有被檢測組織中均有表達,表明他們可能在草魚體內(nèi)發(fā)揮廣泛的作用;3個基因均在脾臟、中腎、

6、頭腎等免疫器官內(nèi)呈現(xiàn)高表達,也體現(xiàn)了其在免疫中起到重要作用。經(jīng)誘導后,3個基因的大多數(shù)組織均出現(xiàn)了在顯著上調(diào)的現(xiàn)象,尤其是免疫相關(guān)組織多在感染早期出現(xiàn)上調(diào)后呈下降趨勢,此外,在皮、腮、腸等粘膜組織中也發(fā)現(xiàn)有參與免疫反應的跡象。分析健康草魚和病毒注射后草魚體內(nèi)3個基因的表達情況,表明草魚呼腸孤病毒可以影響草魚體內(nèi)的C1q相關(guān)基因的表達情況,從而對機體產(chǎn)生一定的影響。
　　5.為了解C1qB、C1qC和C1q-like基因?qū)Σ蒴~的胚胎

7、發(fā)育所起到的作用,通過實時熒光定量PCR技術(shù)對其進行檢測顯示:在卵子中均檢測到3個基因的表達,這表明他們可能遺傳于母本;3個基因均在胚胎發(fā)育早期及檢測到表達,表明他們在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。其中草魚C1qB與C1q-like基因的表達譜較為相似,在胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達量,表明他們可能參與到卵子發(fā)生、受精的過程中。
　　通過以上研究結(jié)果可見,3種基因均在免疫器官中的表達量較高,且受到草魚呼腸孤病毒誘導后表達量都出現(xiàn)顯