草魚明膠酶基因及其抑制劑基因的克隆和表達分析.pdf

1、草魚是我國乃至世界養(yǎng)殖產量最高的魚類,具有悠久的養(yǎng)殖歷史。目前,草魚養(yǎng)殖病害嚴重,帶來了很大的經濟損失,開展草魚免疫因子研究,開發(fā)防病產品、培育抗病力強的草魚新品種是一條重要研究途徑。明膠酶基因是一類重要的免疫因子,它包括基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)基因和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因。本文克隆了草魚這2種明膠酶基因及其抑制劑——基質金屬蛋白酶抑制劑-2b基因和熱休克蛋白60基因,分析了它們的理化性質、氨基酸結構,比較了它們的

2、同源性,采用福爾馬林滅活嗜水氣單胞菌液對這些基因進行了誘導,研究它們在草魚不同發(fā)育過程、不同組織及其受嗜水氣單胞菌感染后的表達情況,取得了如下結果。
　　1.通過同源克隆策略獲得了草魚 MMP-2、MMP-9和HSP60基因部分 cDNA片段,從本實驗室已構建的草魚頭腎均一化文庫中獲得 TIMP-2b基因部分 cDNA片段;由 RACE技術發(fā)現這4個基因的全長序列分別為3102bp,2880bp,2434bp,1224 bp;分別

3、含有編碼658(1974bp),675(2025bp),575(1728bp),218(657bp)個氨基酸的開放閱讀框,MMP-2,MMP-9,TIMP-2b分別含有29,20,24個氨基酸的信號肽序列。
　　2.BLAST分析發(fā)現,草魚 MMP-2,MMP-2,TIMP-2b和HSP60都是高度保守的蛋白家族成員,草魚與鯉魚的MMP-2、MMP-9氨基酸序列相似度最高,分別達到94％、89%;草魚與斑馬魚 TIMP-2b氨基酸

4、序列相似度最高,為83.9%;草魚與金絲魚 HSP60氨基酸序列相似度最高,達96.9%;選取各自蛋白家族不同物種氨基酸序列,通過 MEGA5.0軟件,使用NJ和ML兩種方法構建系統(tǒng)進化樹,均發(fā)現草魚與其它硬骨魚類的的親緣關系最近,這些結果都支持了傳統(tǒng)的進化理論,反應了其實際的親緣關系。
　　3.多序列比對和蛋白功能結構域分析發(fā)現,MMP-2、MMP-9氨基酸序列均含有N端信號肽、前肽,插入催化結構域的3個重復的類纖維連接Ⅱ型蛋白

5、結合區(qū)和C端的類血紅素結構域,但他們的氨基酸序列一致度只有47.2%,表明他們的功能具有一定差異性。草魚 TIMP-2b氨基酸序列包含一個信號肽,N-端和C-端結構域。草魚 HSP60氨基酸序列包含 ATP/Mg2+結合位點、一個鉸鏈結構域和一個環(huán)狀寡聚結構。
　　4.利用實時熒光定量 PCR技術對健康草魚各組織及使用滅活嗜水氣單胞菌誘導后4個基因的表達譜進行檢測,結果顯示:4個基因在所有被檢測組織中均有表達,表明他們可能在草魚體

6、內發(fā)揮廣泛的作用;MMP-2基因在血液、頭腎和鰭條發(fā)現較低的表達水平,MMP-2基因經滅活的嗜水氣單胞菌誘導,在脾臟和頭腎組織表達量,4小時顯著性上調,24小時顯著下調;MMP-9基因和TIMP-2b基因均在血液、頭腎、體腎和脾臟中顯著高表達,草魚 MMP-9基因和TIMP-2b基因誘導后,所有組織的表達量均顯著提高,MMP-2在腸組織的表達量變化不顯著,MMP-9基因在頭腎和心臟的的上調最具顯著性;HSP60基因在血液和肝臟組織中具有

7、顯著高表達,HSP60基因表達情況有明顯時間節(jié)點,表達量在第三天達到峰值,第七天表達水平與對照組相似。分析健康草魚和細菌注射后草魚體內4個基因的表達情況,表明嗜水氣單胞菌可以影響草魚體內的明膠酶基因及其抑制劑基因的表達情況,從而對機體產生一定的影響。
　　5.利用實時熒光定量 PCR技術對4個基因在草魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況進行檢測:在卵子中均檢測到4個基因的表達,這表明他們可能遺傳于母本;其中草魚 MMP-9與 TIMP-2b

8、基因的表達譜及其相似,表達量在后期有所升高;草魚MMP-2與 HSP60基因的表達譜比較相似,都在胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達情況。4個基因均在胚胎發(fā)育早期及檢測到表達,表明他們在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。尤其是 MMP-2和HSP60基因在早期的高表達,表明他們可能參與到胚胎早期的細胞分裂和組織分化的過程中。
　　通過以上研究結果可見,草魚在受到嗜水氣單胞菌侵襲后,體內基因表達已發(fā)生混亂,這可能導致疾病發(fā)生并不斷惡化的原因之