三個柞蠶脂肪酶基因的克隆及表達分析.pdf

1、柞蠶，屬于鱗翅目昆蟲，主要分布于東北、山東和廣西等地，是一種重要的經(jīng)濟昆蟲。柞蠶膿病是一種由柞蠶核型多角體病毒引起的病蟲害，曾經(jīng)造成柞蠶的大量減產(chǎn)。目前對于昆蟲對病原微生物尤其是對細菌的免疫反應(yīng)已經(jīng)取得了顯著的研究進展，但關(guān)于其抗病毒免疫的研究還較少。因此，開展柞蠶抗病毒免疫的研究有著重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　家蠶脂肪酶是一種在家蠶消化液中分離出的具有抗家蠶核型多角體病毒的蛋白，也是目前明確鑒定的為數(shù)不多的一種抗病毒蛋白。依據(jù)此

2、線索我們以柞蠶脂肪體cDNA為模板，克隆了3個柞蠶脂肪酶基因并對其進行了生物信息學(xué)分析。3個基因開放閱讀框長度分別為1000bp、1000bp和876bp，并將其分別命名為lipase1462（GeneBank登錄號:KJ638233），lipase1502（GeneBank登錄號:KJ638234）和lipase1725(GeneBank登錄號:KJ638235)。通過在線預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，3個柞蠶脂肪酶基因均具有脂肪酶家族具有的保守性結(jié)

3、構(gòu)域及活性位點，同屬于脂肪酶家族。
　　為研究柞蠶脂肪酶基因在柞蠶免疫中的作用，利用實時定量的方法測定了脂肪酶基因在經(jīng)不同病原微生物誘導(dǎo)處理的柞蠶蛹不同組織中相對表達量的變化。實驗結(jié)果表明，經(jīng)病原微生物處理后，3個脂肪酶基因的表達量均有顯著的變化，但不同組織中的表達上調(diào)水平具有一定的差異性。為進一步研究柞蠶脂肪酶基因的表達是否與柞蠶對核型多角體病毒(ApNPV)侵染的抗性有關(guān)，利用實時定量PCR技術(shù)檢測3個柞蠶脂肪酶基因在感染Ap

4、NPV后的幼蟲脂肪體和中腸的表達水平變化。結(jié)果表明，柞蠶幼蟲被ApNPV感染48～60h后，脂肪體和中腸中3個脂肪酶基因的表達水平均明顯上調(diào)，初步推測柞蠶脂肪酶可能與柞蠶對ApNPV的免疫反應(yīng)相關(guān)。
　　構(gòu)建了柞蠶脂肪酶基因的原核及真核表達載體，分別利用大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對其進行了原核表達和真核表達。SDS-PAGE電泳檢測顯示3個柞蠶脂肪酶基因在原核和真核系統(tǒng)中均已成功表達。原核表達系統(tǒng)表達的柞蠶脂肪酶以包涵體的形式