草魚三個(gè)PI3K-AKT通路相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idella)是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類。草魚易受病原體感染，一旦感染又易引發(fā)大面積死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失。由于水產(chǎn)疫苗的匱乏和施藥方式易對(duì)水體造成污染，選育抗病力強(qiáng)的草魚良種，成為了防治草魚病害的有效途徑。
　　PI3K/AKT信號(hào)通路，是一種以磷酸化為基礎(chǔ)的信號(hào)通路。有關(guān)草魚PI3K/AKT信號(hào)通路的研究還是空白。本論文克隆了草魚三個(gè)PI3K/AKT相關(guān)基因：AKT1、AKT3以及NF

2、IL3，分析了基因序列和預(yù)測(cè)氨基酸序列的理化性質(zhì)，根據(jù)同源氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。用嗜水氣單胞菌人工感染草魚，檢測(cè)了3個(gè)基因在4種草魚免疫相關(guān)組織中的表達(dá)情況。選取NFIL3基因作為深化對(duì)象，研究了其超表達(dá)對(duì)于細(xì)菌入侵草魚CIK細(xì)胞的影響。取得了以下結(jié)果：
　　1．通過(guò)同源克隆和RACE法得到草魚AKT1、AKT3和NFIL3基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別為1554bp，2808bp，2018bp；分別含有編碼384（1155b

3、p），479（1440bp），468（1407bp）個(gè)氨基酸的開放閱讀框，預(yù)測(cè)出的氨基酸序列均無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)。
　　2．BLAST分析發(fā)現(xiàn)，草魚AKT1，AKT3和NFIL3都是較為保守的蛋白質(zhì)家族成員，草魚AKT3和NFIL3的開放閱讀框與斑馬魚序列相似度最高，同為90％；草魚AKT1的開放閱讀框與斑馬魚序列相似度稍低，為81%；以不同物種的氨基酸序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因的氨基酸序列都可以和其他硬骨魚類的氨基酸序列聚為

4、一束，說(shuō)明草魚與其它硬骨魚類的親緣關(guān)系最近，支持了傳統(tǒng)的進(jìn)化理論。
　　3．普通組織熒光定量表達(dá)結(jié)果顯示草魚AKT1，AKT3和NFIL3三個(gè)基因在所檢的8種組織中均有不同程度的表達(dá)，其中AKT1和NFIL3在肝臟中表達(dá)量最高，AKT3在心臟中表達(dá)量最高。在嗜水氣單胞菌感染草魚后，AKT1基因在草魚肝臟中的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升，AKT3基因在肝臟和中腎中表達(dá)量明顯提高，而NFIL3在中腎以及魚類的免疫中心器官頭腎中的基因表達(dá)量顯著上

5、升，并且通過(guò)Western blotting驗(yàn)證NFIL3蛋白的表達(dá)量在感染后的頭腎、中腎和腸道中也顯著提高。
　　4．構(gòu)建草魚NFIL3超表達(dá)質(zhì)粒載體，將其轉(zhuǎn)染入草魚CIK細(xì)胞后，通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù)，發(fā)現(xiàn)草魚NFIL3主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用相吻合。
　　5．對(duì)超表達(dá)NFIL3后的草魚CIK細(xì)胞進(jìn)行嗜水氣單胞菌侵染，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)草魚NFIL3的CIK細(xì)胞能有效減少細(xì)菌入侵的數(shù)量，