多葉苜蓿懸浮培養(yǎng)系的建立及其影響因子和耐熱性的研究.pdf

1、多葉苜蓿(Multifoliolate Alfalfa)是一種品質優(yōu)良的苜蓿種質材料，隨著研究者對多葉苜蓿研究的不斷深入，其越來越多的生產利用價值被發(fā)現(xiàn)，比如多葉苜蓿營養(yǎng)價值比三葉苜蓿更高、適口性更強等。本研究通過探索多葉苜蓿懸浮細胞系建立的最適條件及其影響因子的研究，試圖為快速高效的獲得多葉苜蓿植株，多葉苜蓿突變體植株的篩選以及更加全面的從細胞層面研究分析多葉苜蓿生長發(fā)育、生長特性和品質、產量特性提供可能。
　　此外，在建立高效

2、的多葉苜蓿懸浮細胞系的基礎上，進一步進行多葉苜蓿懸浮細胞耐熱性的研究，探索高溫對多葉苜蓿懸浮培養(yǎng)的影響，這為研究多葉苜蓿細胞對熱脅迫的反應和適應性的生化機制提供了理論依據，也為篩選出適合江淮地區(qū)種植的耐熱性多葉苜蓿種質提供了可能。
　　本實驗以多葉苜蓿品種飛馬自交二代作為材料，以NAA濃度、6-BA濃度、KT濃度、2，4-D濃度（單位為mg·L-1）、愈傷組織接種量和愈傷組織繼代培養(yǎng)時間這6個主要影響因子作為實驗因素，每個因素設置

3、6個實驗水平。通過均勻設計找到建立多葉苜蓿懸浮細胞系最適的培養(yǎng)條件，并對不同實驗處理下多葉苜蓿懸浮細胞系的形態(tài)指標和生長指標進行觀察和測定，包括多葉苜蓿懸浮細胞顏色、懸浮細胞鮮、干重，懸浮細胞相對生長量，懸浮細胞活力，懸浮細胞密實體積和懸浮液pH值等。
　　主要研究結果如下:
　　1.多葉苜蓿懸浮細胞系建立的最適條件為0.5 mg·L-1 NAA，2.0 mg·L-16-BA，0.2 mg·L-1KT、2.5 mgL-12，

4、4-D、接種0.6g愈傷組織和愈傷組織繼代培養(yǎng)時間為10d。在該條件下多葉苜蓿懸浮細胞的鮮、干重達到最大，PCV含量也較高。多葉苜蓿懸浮細胞系的pH變化范圍為5.34～6.73之間，總體表現(xiàn)前期逐漸下降，后期上升的狀態(tài)。不同處理的最適pH值不一樣，其中處理3懸浮細胞生長的最適pH值為5.87或6.04，此時懸浮細胞鮮、干重和細胞活力均能達到較大值。
　　2.KT濃度、2，4-D濃度、愈傷組織接種量和愈傷組織繼代培養(yǎng)時間等因素的不斷

5、增加對多葉苜蓿懸浮細胞鮮重的增長有抑制作用;隨著KT濃度和愈傷組織接種量的增加對多葉苜蓿懸浮細胞干重有抑制作用;KT濃度和2，4-D濃度的增加會對多葉苜蓿懸浮細胞PCV值的升高起抑制作用;而6-BA濃度和愈傷組織接種量的不斷增大會對多葉苜蓿懸浮細胞PCV值有促進作用;隨著6-BA濃度、2，4-D濃度和愈傷組織繼代培養(yǎng)時間的增大會對多葉苜蓿懸浮細胞干重的增加有促進作用。
　　3.用TTC法測定多葉苜蓿懸浮細胞吸光值時應在618nm波

6、長處進行測定，采用磷酸鈉緩沖液，濃度0.6％ TTC溶液。不同處理條件下懸浮細胞活力表現(xiàn)出兩種不同的變化趨勢，一種為類似拋物線的先增加到最大然后逐漸降低，另一種為先減小后增大的趨勢。其中處理3條件下的懸浮細胞活力變化情況屬于前者。
　　4.通過觀察培養(yǎng)周期為14d的多葉苜蓿懸浮細胞生長過程，可知懸浮細胞液顏色從清澈變渾濁再變?yōu)楹贮S色，氣味也從無味變?yōu)橛挟愇叮瑧腋〖毎L量從少到多，最后有大量細胞團沉淀。繪制干濕生長曲線可發(fā)現(xiàn)多葉苜

7、蓿懸浮細胞培養(yǎng)的2d～6d為延滯期、6d～10d為指數增長期，10d之后進入衰退。處理3在懸浮細胞繼代培養(yǎng)的5d～12d細胞處于旺盛生長階段，此時適合進行多葉苜蓿原生質體培養(yǎng)和繼代篩選工作。所有實驗處理中處理3出愈率最高為59％，愈傷組織鮮重也較高，分化率為58％。多葉苜蓿懸浮細胞形成愈傷組織過程中污染率較高，超過50％均被污染。
　　5.高溫能在一定程度上促進多葉苜蓿懸浮細胞的生長速率，這可能與高溫能促進懸浮細胞的分裂有關。高溫

8、與多葉苜蓿懸浮細胞的褐化密切相關，隨著溫度的升高，懸浮細胞的褐化率也呈上升趨勢。其中在本實驗條件下認為35℃為高溫脅迫多葉苜蓿懸浮細胞系生長的拐點溫度，40℃為多葉苜蓿懸浮細胞系的半致死溫度，45℃高溫時，懸浮細胞重度褐化，死亡現(xiàn)象表現(xiàn)嚴重。高溫會促使多葉苜蓿懸浮細胞脯氨酸含量的增加，這是由于當高溫破壞多葉苜蓿細胞細胞膜透性和活性氧增多時，多葉苜蓿自身的保護機制起作用導致的。在高溫下，脯氨酸含量峰值比常溫下高，而且提前出現(xiàn)，即在高溫培養(yǎng)