草魚(yú)呼腸孤病毒(GCRV096)VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的篩選.pdf

1、草魚(yú)出血病發(fā)病率高、流行范圍廣，且缺乏有效的防治藥物，是草魚(yú)養(yǎng)殖發(fā)展中的瓶頸問(wèn)題。草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)是草魚(yú)出血病的主要病原，主要危害草魚(yú)魚(yú)種，嚴(yán)重影響著我國(guó)淡水漁業(yè)的發(fā)展。實(shí)踐證明，免疫預(yù)防是預(yù)防該病最為有效的方法之一。但是，GCRV與其它的魚(yú)類(lèi)呼腸孤病毒之間無(wú)交叉抗原，且不同病毒株之間也存在著抗原性差異。有研究表明VP6蛋白誘導(dǎo)中和抗體效價(jià)較高，NS38蛋白誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)次之。進(jìn)一步

2、了解VP6和NS38蛋白的免疫原性有助于完善草魚(yú)出血病的免疫預(yù)防方法。病毒入侵宿主后，在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，使細(xì)胞發(fā)生病變，致使宿主發(fā)病死亡。深入了解GCRV的侵染機(jī)制，找到與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，對(duì)病害的防治具有指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)以草魚(yú)呼腸孤病毒株096(GCRV096)為研究對(duì)象，克隆表達(dá)VP6和NS38基因，研究VP6和NS38蛋白的免疫原性；應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與GCRV096 VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白。

3、r>　　克隆VP6和NS38基因，分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP6及pET28a-NS38，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，純化目的蛋白。用純化的目的蛋白分別與CIK細(xì)胞孵育12h、24h、48h，然后對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行病毒感染13h，熒光定量分析不同時(shí)間CIK細(xì)胞中VP6及NS38基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VP6和NS38蛋白引發(fā)CIK細(xì)胞免疫效應(yīng)的強(qiáng)度隨孵育時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，48h時(shí)免疫效應(yīng)最好，VP6蛋白表現(xiàn)的

4、更為明顯。用GCRV096感染CIK細(xì)胞(蛋白孵育48h)4h、8h、13h，熒光定量分析結(jié)果表明，孵育8h時(shí)VP6蛋白引發(fā)的免疫效應(yīng)最強(qiáng)，而NS38蛋白是4h。
　　分別將VP6和NS38基因克隆到誘餌載體pGBKT7，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6及pGBKT7-NS38，轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，并對(duì)誘餌質(zhì)粒進(jìn)行自激活作用及毒性檢測(cè)，結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。利用SMART技術(shù)構(gòu)建了草魚(yú)腎臟細(xì)胞(CIK)的全長(zhǎng)cDNA文

5、庫(kù)，其文庫(kù)容量為2.4×106，文庫(kù)滴度為6.44×107cfu/mL。將含有誘餌質(zhì)粒的Y2HGold菌株與含有文庫(kù)質(zhì)粒的Y187菌株相融合，按照MatehmarkerTM GoldYeast Two-Hybrid System操作手冊(cè)篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)高選擇性培養(yǎng)基確定陽(yáng)性克?。禾崛￡?yáng)性克隆的酵母質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌并提純質(zhì)粒DNA，將其與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，確定相互作用，并對(duì)陽(yáng)性克隆中插入的cDNA進(jìn)行測(cè)序分析。在

6、VP6相互作用蛋白的篩選中得到4株陽(yáng)性克隆，經(jīng)比對(duì)分析得到兩種與其相互作用的蛋白，其中一種與glyeeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)高度同源，另一種未找到典型的同源蛋白；而。NS38蛋白得到3株陽(yáng)性克隆，經(jīng)比對(duì)分析得到兩種與其相互作用的蛋白，其中一種與40S核糖體蛋白S16亞基高度同源，另一種未找到典型的同源蛋白。
　　本論文對(duì)GCRV096 VP6和NS38蛋白的免疫原性進(jìn)行