表達禽呼腸孤病毒σB、σC蛋白的重組馬立克氏病毒的構建.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)感染可以引起的雞和火雞的以關節(jié)炎、鍵鞘炎、吸收障礙為特征的免疫抑制病。該病可導致雞的死亡率增加、病雞增重減少、飼料轉化率下降、產蛋下降、孵化率/受精率降低，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經濟損失。國內外的研究表明目前使用的弱毒疫苗S1133仍可能具有一定的致病性，因此研制安全、有效的新型疫苗對ARV感染的防控具有重要意義。
　　本研究采用RT-PCR擴增ARV GX/2010/1株的σB、σC

2、基因，定向克隆至pEASY-M1表達載體中;再分別將σB、σC基因的表達盒與含有馬立克氏病毒(MDV) CVI988疫苗毒株sorf1/sorf2序列pU/D載體相連，構建含σB、σC基因的轉移載體質粒pU/D-σB和pU/D-σC。分別將pU/D-σB和pU/D-σC與含有GFP報告基因的MDV CVI988基因組DNA以磷酸鈣沉淀法共轉染CEF細胞，通過篩選、純化獲得重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-σC。經PCR、Wester

3、n blot和IFA分析，σB、σC基因分別正確插入到MDV CVI988毒株基因組中，并可以成功表達ARVσB蛋白和σC蛋白。
　　本研究評價了1日齡SPF雞接種重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-σC后對ARVGX/2010/1株及MDV RB1B超強毒株的免疫保護效力。將70只1日齡SPF雞隨機分成5組:rMDV-σB免疫組、rMDV-σC免疫組、S1133疫苗免疫組、非免疫攻毒對照組和健康對照組，從發(fā)病率、死亡率、臨床癥

4、狀、病理組織學變化、對增重的影響和抗體水平等方面評價免疫效力。前兩組的試驗雞1日齡時分別頸部皮下接種5000空斑形成單位(PFU)的r-MDV-σB和r-MDV-σC，第三組于7日齡接種1羽份的S1133疫苗;21日齡時，前四組試驗雞均用1040EID50/雞的ARV GX/2010/1毒株攻擊，攻毒第14天進行剖殺。結果顯示rMDV-σB免疫組和rMDV-σC免疫組在ARV攻毒后的發(fā)病率分別為40％和26.7％與非免疫攻毒對照組發(fā)病率

5、100％存在顯著差異(p＜0.05);攻毒前后(21日齡～35日齡)各免疫組增重差異不顯著(p＞0.05)，但S1133疫苗組和rMDV-σB免疫組增重小于rMDV-σC免疫組。經臨床檢查，攻毒后rMDV-σC免疫組的脾臟病變較S1133疫苗免疫組和rMDV-σB免疫組輕微。
　　本研究還評價了r-MDV-σB和r-MDV-σC分別對MDV RB1B超強毒株攻擊的免疫保護效果。將80只1日齡SPF雞隨機分為4個試驗組:rMDV-σ

6、B免疫組、rMDV-σC免疫組、CVI988/Rispens免疫組和攻毒對照組，每組20只試驗雞;rMDV-σB免疫組、rMDV-σC免疫組和CVI988/Rispens免疫組的試驗雞分別于1日齡時頸部皮下接種5000 PFU/雞的相應疫苗;7日齡時，所有試驗雞經腹腔接種500 PFU/雞的MDV RB1B超強毒株。連續(xù)觀察90天，記錄各試驗組雞的發(fā)病和死亡情況。rMDV-σB免疫組和rMDV-σC免疫組對MDVRB1B強毒株攻擊能夠提