DHBV衣殼蛋白靶向核酸酶抗病毒初步研究.pdf

1、根據(jù)本實驗室提交的鴨乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus，DHBV) CH4株（登錄號EU429324）基因的序列信息以及GenBank上金黃色葡萄球菌核酸酶(登錄號CP006630.1)的序列信息，設(shè)計DHBV衣殼蛋白(Cap)基因和金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的特異性引物。以DHBV病料和金黃色葡萄球菌為模板，對DHBVCH4株Cap基因和金黃色葡萄球菌SNase基因進行PCR擴增。開展了以下研究:<

2、br>　　1.金黃色葡萄球菌核酸酶基因的原核表達及活性分析
　　利用PCR方法對金黃色葡萄球菌核酸酶SNase基因進行擴增，將SNase基因連接至pGM-T載體并進行酶切鑒定及測序，回收目的基因并亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-SNase，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌Rosetta，IPTG誘導表達，收集表達的核酸酶蛋白，同時利用TDA變色法檢測該酶的生物學活性。結(jié)果表明:成功擴增了SNase

3、基因，大小為468bp，與預期片段大小一致;進一步構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)-SNase，轉(zhuǎn)化至表達菌Rosetta，通過IPTG的誘導表達，重組原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)-SNase成功表達分子量大小約為35 KDa核酸酶蛋白;同時檢測出表達的重組核酸酶蛋白具有核酸酶活性，為后續(xù)實驗選擇核酸酶作為抗病毒因子奠定了基礎(chǔ)。
　　2.鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白與金黃色葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大腸桿菌中的表達、活性分析

4、及其抗血清的制備
　　根據(jù)實驗室提交GenBank的DHBV CH4株（登錄號EU429324）完整Cap基因序列和GenBank上金黃色葡萄球菌核酸酶（登錄號CP006630.1）的序列，結(jié)合重疊延伸PCR原理分別設(shè)計引物。以實驗室保存DHBV陽性血清提取DNA作為模板，擴增Cap基因，同時提取金黃色葡萄球菌基因組擴增SNase基因，利用融合PCR技術(shù)擴增Cap-SNase融合基因;連接到pGM-T載體上，經(jīng)酶切和測序鑒定后，目

5、的基因亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)-Cap-SNase，轉(zhuǎn)入表達菌Rosetta;為了提高融合蛋白表達量，對誘導條件（溫度、IPTG濃度、時間）進行優(yōu)化，經(jīng)IPTG誘導表達，獲的融合表達蛋白;表達重組融合Cap-SNase蛋白經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，用兔抗鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白多克隆抗體檢測純化的重組融合蛋白，并進一步將純化的蛋白免疫昆明鼠，制備多克隆抗體;同時TDA變色法檢測

6、純化的融合蛋白是否具有核酸酶蛋白的生物學活性。結(jié)果表明，成功擴增融合基因Cap-SNase，大小為1236bp，與預期片段大小一致;構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-Cap-SNase，轉(zhuǎn)化至表達菌Rosetta，誘導表達蛋白，分子量大小約為60KDa;經(jīng)過誘導條件的優(yōu)化，最終確定了蛋白表達的最優(yōu)條件為:在37℃、IPTG誘導濃度為1.0mmol/L條件下誘導6h，蛋白表達量達到最高值。重組融合蛋白主要以包涵體的形式存在。親和層析

7、純化蛋白條帶單一，同時檢測表達的融合蛋白仍然具有核酸酶的活性，進一步將純化的融合蛋白免疫昆明鼠后，成功制備出其多克隆抗體，雙向瓊脂擴散實驗檢測抗體滴度為1∶8。鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白和金黃色葡萄球菌核酸酶融合蛋白的成功表達且具有核酸酶活性為后續(xù)真核表達奠定了理論基礎(chǔ)，同時制備的鼠多克隆抗體為后續(xù)實驗提供了實驗素材。
　　3.DHBV衣殼蛋白靶向核酸酶真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及瞬時表達
　　選擇15日齡鴨胚，提取鴨胚肝臟用于培養(yǎng)鴨胚

8、肝細胞;構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cap-SNase;轉(zhuǎn)染鴨胚肝細胞，收集轉(zhuǎn)染后48h的鴨胚肝細胞，提取鴨胚肝細胞總RNA，用特異性引物反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，從核酸水平檢測真核表達質(zhì)粒的表達情況，同時提取鴨胚肝細胞蛋白從蛋白水平檢測，通過Western blotting檢測Cap-SNase融合蛋白表達情況;檢測表達融合蛋白核酸酶的生物學活性。結(jié)果表明，成功培養(yǎng)了鴨胚肝細胞，成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-

9、Cap-SNase;真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鴨胚肝細胞后，提取轉(zhuǎn)染后鴨胚肝細胞總RNA，能夠從核酸水平上檢測到真核表達質(zhì)粒表達轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA;用制備的鼠多克隆抗體作為一抗進行檢測，通過Western blotting檢測結(jié)果顯示真核表達質(zhì)粒在鴨胚肝細胞中成功表達，分子量大約為47 KDa;同時，融合蛋白仍然具有核酸酶的生物學活性。
　　4.應用衣殼蛋白靶向滅活策略抗鴨乙型肝炎病毒感染初步研究
　　根據(jù)實驗室所構(gòu)建的pMD18-T

10、-PreS/S質(zhì)粒，建立熒光定量PCR標準曲線，通過標準曲線計算未知樣品中病毒的含量。在體外培養(yǎng)鴨胚肝細胞轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cap-SNase，人工接種鴨乙型肝病毒，收集不同時間點的細胞上清，用于提取細胞上清病毒基因組，熒光定量檢測不同時間點細胞上清中病毒的含量，同時設(shè)置PBS空對照組和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組。熒光定量數(shù)據(jù)通過SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明:應用質(zhì)粒pMD18-T-PreS/S質(zhì)粒成