甜味蛋白Monellin基因的合成、功能分析及對(duì)桑樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、桑樹(shù)(MorusalbaL.)是多年生雙子葉木本植物，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。桑樹(shù)全身都是寶:桑葉被用作家蠶和畜禽的飼料;桑椹中富含花青素等物質(zhì)，現(xiàn)已受到越來(lái)越多人們的喜愛(ài);桑根、桑皮和桑枝等作為一種傳統(tǒng)藥材，被用到中藥中。隨著科技的發(fā)展，桑樹(shù)的價(jià)值將得到最大程度的開(kāi)發(fā)利用，因此，選育新桑品種是研究者的重要任務(wù)之一。桑樹(shù)的傳統(tǒng)育種，如選擇育種、雜交育種等技術(shù)已不能滿足蠶桑產(chǎn)業(yè)向多元化方向發(fā)展的需要，現(xiàn)在越來(lái)越多的研究者開(kāi)始了桑樹(shù)的分子育

2、種相關(guān)研究。很多研究表明，外源基因?qū)ι?shù)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是可行的，但如何獲得適合的外源基因，提高外源基因的表達(dá)量，尋找適合的基因轉(zhuǎn)化方法等都是需要面對(duì)和解決的難點(diǎn)。因此，對(duì)桑樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的研究任重而道遠(yuǎn)。
　　 從西非植物Dioscoreophyllumcumminsii的果實(shí)中獲得的天然的甜味蛋白Monellin，具有甜度高、熱量低等特點(diǎn)。但它的熱穩(wěn)定性較差，其開(kāi)發(fā)生產(chǎn)也受到了產(chǎn)地和資源等因素的限制，難以規(guī)?；Ｒ虼?，研究者運(yùn)用生物

3、技術(shù)的方法，合成了甜昧蛋白基因，并在原核與真核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，獲得的甜味蛋白在酸性環(huán)境下最高能耐受60℃高溫;在1992年報(bào)道了該蛋白在植物中的應(yīng)用，基因被成功導(dǎo)入萵苣和土豆中，但未能檢測(cè)出甜味。
　　 如何能夠提高該蛋白的表達(dá)量和熱穩(wěn)定性，如何能夠?qū)onellin基因?qū)肷?shù)中并得到表達(dá)？本研究圍繞這些問(wèn)題開(kāi)展了較為深入系統(tǒng)的研究，并取得了較好的研究結(jié)果，現(xiàn)將研究要點(diǎn)總結(jié)如下:
　　 1.一個(gè)人工設(shè)計(jì)合成的mon

4、ellin基因
　　 本研究根據(jù)已報(bào)道的Monellin甜蛋白氨基酸序列，通過(guò)統(tǒng)計(jì)“各物種密碼子使用頻率數(shù)據(jù)庫(kù)codonusagedatabase”信息，兼顧桑樹(shù)與畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性，人工設(shè)計(jì)優(yōu)化了一條長(zhǎng)為294bp的單鏈monellin基因，并采用重疊PCR的方法合成該基因。將合成的基因核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示這是一個(gè)具有新核苷酸序列的monellin基因。我們將這一基因向NCBI進(jìn)行了提交，確定基因登錄號(hào)

5、為GenBank:JQ282905。該基因如能在真核生物和植物的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，則為它擴(kuò)展應(yīng)用到其它作物中去提供了新的思路和途徑。
　　 2.新monellin基因的真核表達(dá)研究
　　 本研究中，選取巴斯德畢赤酵母GS115為宿主菌，以胞外分泌型的載體pPIC9K為基礎(chǔ)，構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)載體pPIC9K-M-E和pPIC9K-M。表達(dá)載體pPIC9K-M-E中包含有甜味蛋白monellin基因和綠色熒光蛋白EGFP基因，p

6、PIC9K-M中只包含monellin基因，但它們中均在基因下游帶上了組氨酸標(biāo)簽以方便蛋白的分離純化。構(gòu)建好的表達(dá)載體經(jīng)線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，經(jīng)菌落PCR和平板篩選分別獲得了陽(yáng)性酵母表達(dá)菌株GS115/pPIC9K-M和GS115/pPIC9K-M-E，利用含G418的平板篩選出基因多拷貝酵母菌株后，在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中利用甲醇誘導(dǎo)獲得了表達(dá)上清。然后采用Ni-NTA親和柱純化表達(dá)的蛋白，經(jīng)分析驗(yàn)證兩種蛋

7、白均有甜味，約為標(biāo)準(zhǔn)蔗糖的500倍，甜味刺激來(lái)的慢去的慢;誘導(dǎo)重組菌GS115/pPIC9K-M-E產(chǎn)生的蛋白在熒光顯微鏡下能夠發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，誘導(dǎo)重組子GS115/pPIC9K-M獲得的蛋白產(chǎn)物能耐80℃高溫，pH值在3-12之間時(shí)，蛋白降解較少。這些結(jié)果證明我們獲得的蛋白不但具有甜味，還具有有相對(duì)較高的對(duì)熱穩(wěn)定性，也有較寬的耐酸堿性。這為它的開(kāi)發(fā)利用提供了條件。由此，我們將獲得的monellin基因向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利

8、，并于2012年5月獲正式授權(quán)，專利號(hào)為ZL201010042099.3。該基因的獲得為桑樹(shù)及作物遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)新了一個(gè)有意義的目的基因。
　　 3.利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究monellin基因?qū)ι?shù)的遺傳轉(zhuǎn)化
　　 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中需要大量的植物受體材料，為了高效獲取組培所需的子葉、下胚軸等外植體，本研究特別探索了一種快速促進(jìn)桑種子萌發(fā)的方法-振蕩培養(yǎng)法。實(shí)驗(yàn)并分析了靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)2種培養(yǎng)方式處理下，桑種子萌發(fā)狀態(tài)及萌

9、發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化。結(jié)果顯示:振蕩培養(yǎng)的桑種子萌發(fā)快而整齊，萌發(fā)率高達(dá)99％，比靜置培養(yǎng)分別高9個(gè)百分點(diǎn)。經(jīng)測(cè)定，桑種子萌發(fā)過(guò)程中振蕩培養(yǎng)組的SOD活性高于靜置培養(yǎng)組。內(nèi)源激素測(cè)定結(jié)果顯示，IAA和GA均參與了桑種子的萌發(fā)過(guò)程，且相對(duì)較低濃度的IAA和較高濃度的GA能促進(jìn)桑種子的萌發(fā);當(dāng)GA含量遠(yuǎn)高于ABA含量時(shí)，能大大促進(jìn)桑種子的萌發(fā)與幼苗的生長(zhǎng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，振蕩培養(yǎng)比靜置培養(yǎng)方式不僅可以提

10、前2天以上獲得萌發(fā)桑苗，縮短桑樹(shù)組培時(shí)間，還能減少外植體被真菌等感染的機(jī)率。
　　 本研究采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉介導(dǎo)法對(duì)monellin基因在桑樹(shù)中的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-M，以“桂優(yōu)62號(hào)”、“特優(yōu)2號(hào)”、“河南?！焙汀凹瘟?0號(hào)”桑樹(shù)品種的子葉、下胚軸和叢生芽為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，經(jīng)基因轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根煉苗等獲得了6株基因轉(zhuǎn)化苗，其中“嘉陵30號(hào)”和“桂優(yōu)62號(hào)”各3株。經(jīng)

11、過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“嘉陵30號(hào)”叢生芽和“桂優(yōu)62號(hào)”下胚軸是較好的遺傳轉(zhuǎn)化受體，其中共轉(zhuǎn)化215個(gè)受體材料，經(jīng)鑒定獲得4株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)化率為1.9％;而以“河南?！钡慕M培外植體作為遺傳轉(zhuǎn)化受體沒(méi)有獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗。實(shí)驗(yàn)表明，不同品種資源的桑材料用作轉(zhuǎn)化受體時(shí)，其遺傳轉(zhuǎn)化效果存在較大差異。實(shí)驗(yàn)也表明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化桑樹(shù)是可行的。
　　 4.利用花粉介導(dǎo)法研究monellin基因?qū)ι?shù)的遺傳轉(zhuǎn)化
　　 本研究借鑒研究室李軍