花生抗逆基因AhRab7的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析.pdf

1、Cloning，GeneticTransformationandFunctichalAnal?！k欠“andunctionalAnalysisotStressresistantGenesAab7inPeanutThesissubmittedtoO躉ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceLiRui(Depar

2、tmentofLifeScience)Supervisor：WangJingshanQingdaoChinaJune，2012青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要花生是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在中國(guó)花生主要分布在干旱和半干旱地區(qū)，經(jīng)常面臨干旱和鹽堿的脅迫，嚴(yán)重影響了花生的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。然而花生栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄，常規(guī)育種難以選育出高抗品種。當(dāng)前發(fā)展迅速的基因工程技術(shù)為植物遺傳改良提供了新的途徑，利用在干旱、鹽脅迫應(yīng)答中起重要作用的基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

3、是獲得抗逆新種質(zhì)的重要手段。植物為適應(yīng)和抵抗干旱、高鹽等逆境脅迫，進(jìn)化了一系列的機(jī)制，其中之一是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的激活，小GTP結(jié)合蛋白就是其中的一類。Rab蛋白是小GTP結(jié)合蛋白家族成員之一，有些Rab蛋白在抵抗非生物脅迫方面起著重要的作用。本研究從花生中克隆得到了AhRabG3b和AhRabG3f2個(gè)基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析、原核表達(dá)和過(guò)量表達(dá)分析，并研究了這2個(gè)基因在不同脅迫環(huán)境下的表達(dá)模式，主要結(jié)果如下：從花生栽培種徐州684中克

4、隆得到AhRabG3b和AhRabG3f基因的cDNA和DNA序列，兩基因的cDNA序列大小分別為681bp和798bp，均包含完整的開(kāi)放閱讀框，分別編碼205和206個(gè)氨基酸。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，兩者均為親水性非跨膜蛋白。與其他物種的Rab7蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示兩個(gè)基因都含有Rab7的保守結(jié)構(gòu)序列，且AhRabG3b與其他物種Rab7的同源性為711％一917％；AhRabG3f與其他物種Rab7的同源性

5、為734％～951％。兩基因的DNA序列大小分別為1736bp和3254bp?；駻hRabG3b含有6個(gè)內(nèi)含子，大小分別為86bp、241bp、92bp、416bp、71bp、149bp；基因AhRabG3f也含有6個(gè)內(nèi)含子，大小分別為328bp、162bp、768bp、102bp、158bp、938bp，且兩基因所有內(nèi)含子的剪切方式均符合GTAG規(guī)則。利用克隆得到的eDNA全長(zhǎng)序列，分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28aAhRaG3b和

6、pET28aAhRabG罩廳將上述原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21，誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行NaCI、PEG和NaHC033種脅迫條件下的抗逆性分析。結(jié)果表明，含有pET28aAhRaG3b和pET28aAhRabG3f質(zhì)粒的重組菌在上述各種脅迫條件抗逆能力顯著強(qiáng)于含pET28a質(zhì)粒的對(duì)照菌株。為了研究這2個(gè)基因在花生抗逆脅迫中的作用，分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pROKIIAhRabG3b和pROKIIAhRabG3fo以子葉為外植體，利用