血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵蛋白IPSE基因合成、表達(dá)及功能分析.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是一種危害人類(lèi)健康的重要的地方性傳染病。血吸蟲(chóng)之所以能長(zhǎng)期寄生于人體內(nèi)，主要的原因是血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵的排泄分泌抗原能夠誘導(dǎo)宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫反應(yīng)類(lèi)型的偏移，由感染初期的具有抗血吸蟲(chóng)感染功能的Th1型保護(hù)性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谘x(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的Th2型免疫反應(yīng)。血吸蟲(chóng)排泄分泌抗原來(lái)源于血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵，與宿主免疫系統(tǒng)直接接觸，是活體血吸蟲(chóng)存在于宿主體內(nèi)的直接證據(jù)，檢測(cè)這些蟲(chóng)源性分子或針對(duì)這些分子的特異性抗體具有重要的診斷意義。同

2、時(shí)，研究這些分子的功能也將有助于闡明血吸蟲(chóng)感染免疫機(jī)制，對(duì)于發(fā)展高效疫苗，免疫佐劑以及發(fā)展自身免疫性疾病的預(yù)防措施同樣具有重要的促進(jìn)作用。 已有的研究表明曼氏血吸蟲(chóng)的蟲(chóng)卵蛋白IPSE(IL4-inducing principle of Smansonieggs)分子在蟲(chóng)卵中含量豐富，是一種外分泌糖蛋白。以此抗原檢測(cè)血吸蟲(chóng)病血清抗體，表現(xiàn)出高度的特異性和敏感性，具有較高的診斷價(jià)值和一定的療效考核價(jià)值。同時(shí)該分子還是一種有效的免疫調(diào)

3、節(jié)劑，能促進(jìn)IL-4水平升高，增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答。對(duì)日本IPSE樣分子的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究根據(jù)曼氏血吸蟲(chóng)的IPSE基因DNA序列，人工合成IPSE基因，制備了具有天然功能活性的重組IPSE蛋白，為未來(lái)采用cDNA文庫(kù)篩選的方法發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)IPSE樣蛋白分子基因，發(fā)展新的血吸蟲(chóng)病診斷方法、免疫干預(yù)措施提供了條件。本研究包括如下三個(gè)部分內(nèi)容： 1.曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵IPSE基因合成與鑒定根據(jù)編碼IPSE成熟肽基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)

4、14條末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段(每條長(zhǎng)50bp)，并進(jìn)行化學(xué)合成。以此14條寡核苷酸片段為引物進(jìn)行OverlappingPCR，獲得長(zhǎng)度為417bp的IPSEDNA片段。將合成的DNA片段插入到TA克隆載體pGEM-T中后進(jìn)行DNA序列分析。測(cè)序結(jié)果顯示合成的IPSE序列與天然基因序列完全一致，表明本研究的曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵IPSE基因合成獲得成功。 2.IPSE基因的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)將IPSEDNA片段定向克隆到表

5、達(dá)載體pET32a(+)的硫氧還蛋白(Trx)序列下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒IPSE/pET32a(+)。重組質(zhì)粒IPSE/pET32a(+)轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中獲得含此重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)化子細(xì)菌能表達(dá)分子量約35.7kDa的蛋白分子，與預(yù)計(jì)Trx-IPSE融合蛋白分子量大小相符。 3.Trx-IPSE融合蛋白純化、復(fù)性與功能研究大量制備表達(dá)產(chǎn)物，用鎳螯合親和層

6、析膠在變性條件對(duì)該重組融合蛋白進(jìn)行純化，獲得純化重組Trx-IPSE融合蛋白。用大量PBS對(duì)變性融合蛋白進(jìn)行透析，獲得部分復(fù)性的可溶性重組Trx-IPSE融合蛋白。免疫印漬分析表明，無(wú)論變性還是復(fù)性的Trx-IPSE融合蛋白均能夠被抗血吸蟲(chóng)天然IPSE蛋白的IgG抗體所識(shí)別；以羊抗人IgE為二抗，顯示融合蛋白Trx-IPSE能與健康人血清中IgE抗體非特異性結(jié)合，說(shuō)明重組表達(dá)的IPSE蛋白同樣具有與IgE抗體結(jié)合的能力。 本研究