棉鈴蟲兩種C-型凝集素HaCTL3和HaCTL7的功能研究.pdf

1、與脊椎動(dòng)物相比，無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)相對(duì)更為簡單，缺少傳統(tǒng)意義上的獲得性免疫系統(tǒng)。免疫反應(yīng)的開啟是通過模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors，PRRs)識(shí)別病原物的病原相關(guān)分子(pathogen-associatedmoleculepatterns，PAMPs)，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。無脊椎動(dòng)物中有許多模式識(shí)別受體，其中C-型凝集素就屬于一大類蛋白家族。本研究組在前期工作中通過對(duì)棉鈴蟲免疫刺激后的脂肪體組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

2、組測序，找到了六種C型凝集素序列。我們挑選其中的兩個(gè)基因HaCTL3和HaCTL7來進(jìn)行研究。我們對(duì)HaCTL3和HaCTL7，及HaCTL7N端CRD（HaCTL7D1）和C端CRD(HaCTL7D2)進(jìn)行了原核表達(dá)、純化。獲得重組蛋白后，我們對(duì)蛋白的體外（細(xì)菌凝集，包囊）和體內(nèi)（黑化）活性進(jìn)行了一系列的研究分析。具體結(jié)果如下:
　　1.棉鈴蟲C-型凝集素HaCTL3原核表達(dá)、純化與功能研究
　　我們從棉鈴蟲脂肪體中克隆得

3、到一種新型的C-型凝集素HaCTL3。HaCTL3、表達(dá)載體pET-32a(+)同時(shí)用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選、測序驗(yàn)證后成功得到陽性克隆。并在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)出重組蛋白rHaCTL3，將細(xì)胞破碎后取沉淀經(jīng)變性復(fù)性后，過Ni純化柱得到可溶且具有生物活性的重組蛋白。其大小在50kDa左右。
　　將重組蛋白進(jìn)行了凝集、包囊和黑化等試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白rHaCTL3對(duì)實(shí)驗(yàn)中的三種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄

4、球菌、微桿菌、生淀粉糖化酶菌）和四種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、反消化細(xì)菌、放射型根瘤菌、弧菌）均具有凝集活性，并且活性依賴于Ca2+的存在。其中rHaCTL3對(duì)大腸桿菌的凝集活性最為明顯。rHaCTL3的凝集活性對(duì)Ca2+的最小依賴濃度相差不大。體外糖抑制實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)rHaCTL3主要受到Mal、LPS、PGN抑制。推測其對(duì)Mal等相關(guān)糖的一類病原物能進(jìn)行特異性地識(shí)別。蛋白體外和凝膠珠孵育后，可促進(jìn)血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包被。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，重組蛋白

5、與凝膠珠孵育后可以促進(jìn)對(duì)凝膠珠的黑化作用，暗示rHaCTL3在激活酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程起作用。
　　2.棉鈴蟲C-型凝集素HaCTL7及其糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域HaCTL7D1、HaCTL7D2原核表達(dá)、純化與功能研究
　　同上述HaCTL3類似，首先通過基因克隆分別得到HaCTL7成熟肽序列和單結(jié)構(gòu)域HaCTL7D1、HaCTL7D2基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)三部分基因片段和表達(dá)載體pET-32a同時(shí)雙酶切，同樣構(gòu)建好三種重組表

6、達(dá)質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，IPTG誘導(dǎo)得到重組蛋白rHaCTL7、rHaCTL7D1、rHaCTL7D2，其分子量分別為46kDa、28kDa、30kDa。功能研究發(fā)現(xiàn)，rHaCTL7和rHaCTL7D2在Ca2+存在下，能對(duì)實(shí)驗(yàn)中三種革蘭氏陽性菌和四種陰性菌產(chǎn)生凝集，且它們的凝集能力相比較rHaCTL3更為顯著，對(duì)各種細(xì)菌的最小凝集濃度更低。且rHaCTL7和rHaCTL7D2對(duì)各種細(xì)菌的凝集能力相當(dāng)，無明顯差異。它們對(duì)Ca2+的依賴

7、程度和rHaCTL3相近。
　　除凝集作用外，rHaCTL7和rHaCTL7D2還可以參與細(xì)胞反應(yīng)如包囊，通過實(shí)驗(yàn)組中重組蛋白和凝膠珠孵育后，能明顯增強(qiáng)血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包被作用。同時(shí)rHaCTL7和rHaCTL7D2也增強(qiáng)了對(duì)凝膠珠的黑化作用，暗示它們參與了酚氧化酶的激活。N端的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域rHaCTL7D1的功能分析表明，rHaCTL7D1既不參與對(duì)細(xì)菌的凝集，也沒有促進(jìn)血細(xì)胞對(duì)凝膠珠的包被和黑化，暗示它可能在其它的免疫過程中發(fā)