魚(yú)腥草SSR引物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、魚(yú)腥草(Houttuynia cordata Thunb)是三百草科蕺菜屬多年生草本植物，在我國(guó)分布較廣，其不同地理居群在農(nóng)藝學(xué)性狀、藥用成分（如黃酮、揮發(fā)油等）及含量上都有較明顯的差異。SSR標(biāo)記是一種短串聯(lián)重復(fù)序列分子標(biāo)記，具有遺傳多樣性高、信息量豐富且呈現(xiàn)共顯性等特點(diǎn)。本研究首次應(yīng)用魚(yú)腥草的EST信息，建立魚(yú)腥草EST-SSR標(biāo)記，并篩選與利用部分標(biāo)記對(duì)魚(yú)腥草不同地理居群遺傳多樣性進(jìn)行初步分析。具體研究結(jié)果如下:
　　 (

2、1)分析魚(yú)腥草EST中SSR的發(fā)生頻率及分布特性。利用魚(yú)腥草EST，進(jìn)行SSR篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSR序列3487個(gè)（1313個(gè)SNPs除外），其中二核苷酸重復(fù)序列有1278個(gè)，三核苷酸重復(fù)序列為1994個(gè)，分別占全部SSR序列的36.65％和57.18％，而其余類型的重復(fù)序列只占全部序列的6.17％;對(duì)魚(yú)腥草EST-SSR進(jìn)行特性分析，發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草二核苷酸重復(fù)以AG/CT為主，占全部二核苷酸重復(fù)序列的86.70％，三核苷酸重復(fù)以GAA/CT

3、T為最多，占全部三核苷酸重復(fù)序列的16.85％，說(shuō)明魚(yú)腥草SSR具有明顯的偏倚性。分析魚(yú)腥草SSR長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度在20bp以上的有749條，在12-20bp之間的有2189條，表明魚(yú)腥草EST-SSR的多態(tài)信息含量較高。
　　 (2)建立魚(yú)腥草EST-SSRs標(biāo)記并對(duì)其引物的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。以峨眉蕺菜DNA為材料，對(duì)魚(yú)腥草EST-SSR的PCR體系進(jìn)行探索，結(jié)果表明:較佳的PCR反應(yīng)的體系為20μL，其中各試劑用量為14

4、.4μL ddH2(0)、2μL10×buffer、1.2μL MgCl2、0.5μL dNTP、上游引物、下游引物各0.35μL、Taq酶0.2μL、25ng/μL的模板1μL。PCR條件為94℃5min;94℃30s;56-58℃45s;72℃45s;72℃10min。利用50對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28對(duì)能夠擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，利用這28對(duì)引物進(jìn)一步檢測(cè)江蘇如皋和福建廈門2個(gè)地理居群多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對(duì)引物

5、具有多態(tài)性。
　　 (3)分析不同來(lái)源地魚(yú)腥草遺傳多樣性。利用(2)篩選到的20對(duì)引物，對(duì)17份不同地理來(lái)源魚(yú)腥草DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出141條核酸條帶，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出7.05條帶。其中有73條具有多態(tài)性位點(diǎn)，其多態(tài)性率為51.7％。17份不同地理居群魚(yú)腥草的遺傳相似率在0.6667-0.8936之間，平均為0.7802，表現(xiàn)出高度遺傳多樣性。聚類分析表明，17份不同居群的魚(yú)腥草，被分成了兩大類，其一類是主要分布在我