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文檔簡介
1、以‘紅核子’龍眼EC轉錄組數據為基礎進行EST-SSR分子標記研究,共計開發(fā)多態(tài)性引物11對,完成EST-SSR-PCR試驗體系的優(yōu)化,將所優(yōu)化的EST-SSR標記應用于龍眼的親緣關系分析,并與ISSR分子標記進行比較分析。具體研究結果如下:
1、龍眼EST-SSR位點特征分析
以本實驗室已經獲得的紅核子龍眼EC轉錄組數據為材料,經MISA軟件的SSR位點檢索與分析,共檢索出5710個EST-SSR位點,且EST-S
2、SR位點出現頻率為8.28%,位點間平均距離為5.41 kb,包含796種基元。從數量上分析,二核苷基元和三核苷基元所占比例最大,分別為43.35%和32.73%,二者共占總EST-SSR位點的76.08%,為優(yōu)勢核苷基元。從EST-SSR位點的基元種類來看,六核苷基元與五核苷基元的種類最多,分別為389種和244種,所占比例分別為48.87%和30.65%,二者占全部EST-SSR基元種類的79.52%。EST-SSR位點的檢索結果還
3、表明,二核苷酸基元中,(AG)n=(TC)n和(CT)n=(GA)n所占比例分別為17.55%和15.17%,是優(yōu)勢重復類型;而(CG)n=(GC)n重復類型出現頻率最低,僅為0.00725%,表現出明顯的GC偏倚性;在三核苷基元中,(AGA)n=(TCT)n是最優(yōu)重復類型,占總EST-SSRs的比例為2.92%,其次為(CTT)n=(GAA)n、(AAG)n=(TTC)n,所占比例分別為2.71%、2.59%。綜上,紅核子龍眼EC轉錄
4、組序列中EST-SSR位點含量豐富。
2、龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化
通過L16(44)正交試驗,得到龍眼EST-SSR-PCR的最優(yōu)應體系為:DNA模板80 ng,0.15 mmol/L dNTPs2μL,0.1μmol/L上下游引物各1μL,Tap酶1.5 U;非優(yōu)化試驗因素10×PCR Buffer(1.5mM Mg2+)2.5μL,ddH2O補足至25μL。分別隨機選取3對引物和8份龍眼種質樣本的D
5、NA作為模板對該優(yōu)化體系進行驗證,電泳結果顯示:擴增條帶清晰平整、無引物二聚體、無非特異擴增、背景干擾小,說明得到的優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。
3、龍眼EST-SSR多態(tài)性分析
依據所分析的龍眼EST-SSR位點序列特征,使用Primer Premier5軟件共設計50對長度在18-24 bp的引物,引物對的擴增片段長度為100-300 bp。再以‘立冬本’的 DNA為模板,對所設計引物的可用性進行驗證,結果顯示50對引物中
6、共有19對的擴增片段符合預期大小。進一步以95份供試龍眼種質的DNA為模板進行PCR擴增,10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示,其中有11對引物擴增的多態(tài)性良好,主帶明亮清晰,無拖尾、無彌散、背景干擾小,多態(tài)性引物開發(fā)得率達22%。這11對引物在95份龍眼種質中的擴增多態(tài)性表現為:共獲得114條譜帶,多態(tài)性位點比例達100%;多態(tài)性位點的數量分布范圍在5-25個,其中LY-43引物對所擴增的多態(tài)性位點數最多(共25個),LY-9引物對
7、的多態(tài)性位點最少(僅5個);平均每個龍眼EST-SSR標記能夠擴增10.36條多態(tài)性譜帶,說明基于紅核子龍眼EC轉錄組開發(fā)的EST-SSR標記具有豐富多態(tài)性。
4、龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析
本試驗分別運用EST-SSR與ISSR對95份供試龍眼種質進行了親緣關系研究。EST-SSR分子標記開發(fā)的11對引物對供試龍眼材料擴增譜帶的分布范圍為5-25條,分布范圍較廣,每對引物的平均多態(tài)位點為10.36個;I
8、SSR分子標記所使用的10對UBC引物對供試龍眼材料擴增譜帶分布范圍8-12條,分布范圍較窄,每對引物的平均多態(tài)位點為9.50個;EST-SSR擴增的平均多態(tài)性位點比ISSR多。此外,電泳結果表明EST-SSR標記所開發(fā)的特異引物比ISSR分子標記通用UBC引物更能高效結合到樣本DNA;從開發(fā)所得的11對EST-SSR引物中獲得5對特異標記:LY-5、LY-38、LY-43、LY-45、LY-48,若加大龍眼EST-SSR特異標記引物的
9、開發(fā)力度,將有利于龍眼種質資源的鑒別。
基于EST-SSR標記的聚類結果顯示95份供試龍眼種質能被有效區(qū)分,聚類結果為2大組、8類群。其中,‘荔枝龍眼’單獨聚為一組,表明其遺傳背景獨特,有別于其他龍眼種質;‘荔枝龍眼’和‘荔龍’不是同一品種。一些地方品種如‘南安1號’和‘農科所3號’被聚類在一起,表明其遺傳背景相似;供試的東壁龍眼種質被聚類為不同的類群,說明不同東壁品種龍眼之間仍存在遺傳多態(tài)性;此外也揭示出個別品種如‘碼頭1號
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