尼羅羅非魚精巢支持細胞、精原干細胞的分離培養(yǎng)及添加物對其生長增殖的影響.pdf

1、實驗一 目的：分離培養(yǎng)尼羅羅非魚精巢支持細胞(Sertoli Cells，SCs)，探討不同添加物對尼羅羅非魚精巢支持細胞生長增殖的影響。 方法：無菌取發(fā)育至第III期的尼羅羅非魚精巢，PBS清洗后，剪碎精巢組織，0.25％胰蛋白酶消化，用含10％犢牛血清(new bovine serum，NBS)的L-15培養(yǎng)液終止消化，過濾，離心，獲得細胞。用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液稀釋細胞后，將細胞培養(yǎng)在鋪有明膠的培養(yǎng)瓶中，

2、并依據(jù)SCs比生殖細胞貼壁速度快的特性，篩選SCs。在26℃、無CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)SCs。甲基綠染色。倒置顯微鏡下，觀察SCs的形態(tài)。生長良好的SCs培養(yǎng)在96孔板中，分別采用含10％NBS的L-15、M199、F12培養(yǎng)液，含5％、10％、15％NBS的L-15培養(yǎng)液，含1％羅非魚血清的L-15+10％NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚SCs。各組每2d取6孔細胞，血球計數(shù)板計細胞數(shù)，繪制SCs生

3、長曲線。 結(jié)果：胰蛋白酶消化分離精巢組織，L-15+10％NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚SCs。培養(yǎng)1～2d，SCs開始貼壁并極化；培養(yǎng)3～5d，細胞完全貼壁并迅速增殖。開始貼壁生長時，SCs呈長柱狀或三角形。單個SCs呈不規(guī)則多邊形，核位于胞質(zhì)中央，呈卵圓形，胞質(zhì)中可見吞噬顆粒和空泡，空泡聚集于支持細胞胞質(zhì)的兩極或散布于核的四周。SCs在L-15培養(yǎng)液中貼壁生長，在F12、M199培養(yǎng)基中較難貼壁。與F12、M199培養(yǎng)液相

4、比，L-15培養(yǎng)液更有助于尼羅羅非魚SCs生長增殖(P<0.01)。與添加5％NBS、15％NBS相比，在L-15培養(yǎng)中添加10％NBS更有助于尼羅羅非魚SCs生長增殖(P<0.05)。與無尼羅羅非魚血清相比，在10NBS+L-15培養(yǎng)中添加1％尼羅羅非魚血清能顯著促進SCs生長增殖(P<0.05)。 結(jié)論：采用胰酶消化、10％NBS+L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚精巢支持細胞；采用10％NBS+1％羅非魚血清+L-15培養(yǎng)

5、液培養(yǎng)，能顯著促進尼羅羅非魚精巢支持細胞生長增殖。 實驗二 目的：分離、培養(yǎng)、鑒定尼羅羅非魚精原干細胞(spermatogonial stemcells，SSCs)，探討不同添加物對尼羅羅非魚精原干細胞生長增殖的影響。 方法：無菌取發(fā)育第III期以內(nèi)的尼羅羅非魚精巢，PBS清洗后，剪碎精巢組織，0.5mg/L膠原酶消化30min后，未完全消化精巢組織塊用0.25％胰蛋白酶-EDTA繼續(xù)消化5min，用含10％NB

6、S的L-15培養(yǎng)液終止消化，離心，收集細胞。用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液懸浮細胞，并依據(jù)SSCs比支持細胞貼壁速度慢的特性，篩選尼羅羅非魚SSCs。在26℃、無CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，用含5％NBS+10ng/mlLIF+1％羅非魚血清的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚SSCs。采用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AKP)染色和體外分化實驗對分離培養(yǎng)的尼羅羅非魚SSCs進行鑒定。在有支持細胞飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層的條

7、件下，培養(yǎng)尼羅羅非魚SSCs，測定SSCs分裂指數(shù)。在有支持細胞飼養(yǎng)層的條件下，分別采用添加2％、5％、10％NBS的L-15培養(yǎng)液，添加1％、2％、3％羅非魚血清的L-15+5％NBS培養(yǎng)液，添加5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL白血病抑制因子(leukemia.inhibitor factor，LIF)的L-15+5％NBS+1％羅非魚血清培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚SSCs，比較不同添加物對尼羅羅非魚SSCs生長增殖的影響。

8、 結(jié)果：SSCs貼壁時間為1～3d，3d后細胞開始分裂增殖。SSCs培養(yǎng)約10d可形成數(shù)十個SSCs克隆，AKP染色陽性。在無支持細胞飼養(yǎng)層、培養(yǎng)液不添加LIF的條件下，長期培養(yǎng)，少數(shù)SSCs可分化形成類神經(jīng)元樣細胞。在有支持細胞飼養(yǎng)層時，SSCs分裂指數(shù)明顯高于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的SSCs，支持細胞飼養(yǎng)層明顯促進精原干細胞分裂增殖(P<0.01)。與添加2％、10％NBS相比，添加5％NBS能顯著促進精原干細胞生長增殖(P<0.01)。

9、添加1％、2％、3％尼羅羅非魚血清對SSCs沒有顯著的促生長增殖作用。添加5ng/mL、10ng/mLLIF可促進SSCs增殖，添加15ng/mLLIF則抑制SSCs增殖，添加10ng/mLLIF更有助于SSCs生長增殖。 結(jié)論：采用膠原酶、胰蛋白酶-EDTA兩步消化，5％NBS+10ng/mL LIF+1％羅非魚血清+L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚精原干細胞；使用尼羅羅非魚精巢支持細胞作飼養(yǎng)層，5％NBS+10ng/mL