黃瓜營養(yǎng)體苦味基因Bi的克隆及功能解析.pdf

1、黃瓜是世界性的重要蔬菜作物之一，在全球蔬菜供應(yīng)中具有舉足輕重的地位。然而在黃瓜生產(chǎn)上，特別是在保護(hù)地條件下，由于遺傳因素及栽培管理和技術(shù)使用不合理，會使果實(shí)產(chǎn)生苦味，導(dǎo)致收益損失。黃瓜的苦味是由一類稱為苦味素或葫蘆素C(CucurbitacinsC)的物質(zhì)引起的，Bi基因控制著黃瓜營養(yǎng)體中苦味，Bt基因控制著果實(shí)中的苦味，bi基因與Bt基因存在互作效應(yīng)，純和基因型bibi對Bt具有隱性上位作用。研究黃瓜營養(yǎng)體及果實(shí)中苦味基因的遺傳規(guī)律及

2、葫蘆素C合成代謝過程中的關(guān)鍵基因，明確苦味形成的分子機(jī)理對于指導(dǎo)育種工作者正確選擇選配親本、進(jìn)行無苦味黃瓜的分子標(biāo)記育種具有重要意義。
　　黃瓜(CucumissativusL)全基因組測序完成后，借助黃瓜高密度遺傳圖譜和高分辨率作圖，將Bi基因定位在六號染色體約35Kb的物理區(qū)間。本研究通過比較基因組學(xué)找到并克隆了Bi候選基因Csa680，通過酵母、煙草表達(dá)系統(tǒng)以及遺傳轉(zhuǎn)化對Csa680基因進(jìn)行功能研究，最終確定了Csa680基

3、因具有環(huán)化酶功能，Csa680蛋白作用于2，3-氧化角鯊烯，生成葫蘆二烯醇，Csa680基因在葫蘆素C合成工程中起著關(guān)鍵作用，即Csa680基因?yàn)锽i基因。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)Bi基因的克隆:通過比較基因組學(xué)分析，在黃瓜中找到了四個環(huán)化酶:Csa846、Csa507、Csa680、Csa845，將這四個環(huán)化酶與擬南芥和西葫蘆中的環(huán)化酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)Csa680基因跟西葫蘆(Cucurbitapepo)葫蘆二烯醇合

4、成酶(CPQ)同源性高達(dá)90％。
　　(2)酵母表達(dá)系統(tǒng):構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-Csa680，經(jīng)酵母轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)后，通過堿裂解法提取酵母中代謝產(chǎn)物，進(jìn)行GC-MS檢測，驗(yàn)證了Csa680基因具有環(huán)化酶功能，Csa680蛋白能催化2，3-氧化角鯊烯環(huán)化，形成葫蘆二烯醇。
　　(3)煙草瞬時表達(dá):構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-Csa680，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Csa680基因?qū)胫参锛?xì)胞中，經(jīng)瞬時表達(dá)，產(chǎn)生有功能的Cs

5、a680蛋白，Csa680蛋白作用于氧化角鯊烯，使其環(huán)化產(chǎn)生葫蘆二烯醇，通過此實(shí)驗(yàn)證明了Csa680基因具有環(huán)化酶功能。
　　(4)遺傳轉(zhuǎn)化:構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-Csa680，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將Csa680基因轉(zhuǎn)化到無苦味黃瓜品種151G中，通過PCR檢測獲得了四株陽性苗:TG6、TG10、TG15、TG16。基因表達(dá)分析表明轉(zhuǎn)基因植株中Csa680基因的表達(dá)量均比對照株高。dCAPs實(shí)驗(yàn)確定了Cs