不同抗螨性能東方蜜蜂obp3基因的克隆與表達(dá)變化規(guī)律的研究.pdf

1、本文旨在分析不同抗螨特性的東方蜜蜂的obp3基因的全序列的差異以及obp3基因在不同抗螨性能東方蜜蜂中時空表達(dá)變化規(guī)律,以尋找obp3基因與蜜蜂抗螨性能的相關(guān)性,并制備東方蜜蜂OBP3多克隆抗體,為后續(xù)研究提供材料。
　　1.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中西方蜜蜂(Apis mellifera L.)obp3(odorant binding protein 3)基因的cDNA序列設(shè)計引物,以東方蜜蜂cDNA為模板克隆并測序獲得obp3cDN

2、A基因全序列。結(jié)果顯示,東方蜜蜂蜂螨易感組和抗螨組除在192位點存在c/t(L/F)的有義突變外,在164位點存在a/g,200位點存在g/a,341位點存在g/a的無義突變;西方蜜蜂與東方蜜蜂螨組相比,前者在51-53位點存在三個堿基cag的缺失使得其編碼的氨基酸缺少一個谷氨酰胺(Q),在159,161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374,452位點存在著a/c(I/L),a

3、/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g(L/V),t/c(L/V),a/c(R/S)的有義突變,體現(xiàn)了兩者在物種上的差別。
　　2.對不同抗螨性能東方蜜蜂obp3基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果表明obp3基因在抗螨組腹部與頭部表達(dá)量最高,同時與螨易感組在頭部與腹部的表

4、達(dá)量差異顯著,對東方蜜蜂螨易感組不同日齡obp3基因表達(dá)量的熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,抗螨組的東方蜜蜂obp3基因在頭部與腹部的表達(dá)量大體趨勢是隨日齡增長而增加。東方蜜蜂obp3基因全序列測序結(jié)果與時空表達(dá)變化研究結(jié)果共同表明,抗螨組東方蜜蜂的obp3基因與螨易感組東方蜜蜂的obp3基因不僅在序列上有堿基突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變異,并且在obp3基因表達(dá)量上差異也很明顯,這兩點共同說明了obp3基因?qū)|方蜜蜂抗螨性能有影響。
　　3.

5、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示OBP3蛋白共有148個氨基酸,分子式為C766H1221N205O235S16,分子量為17575.3,理論等電點為4.94,估計半衰期為30h。OBP3蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白,不穩(wěn)定指數(shù)為40.94,脂肪指數(shù)為89.53,親水指數(shù)為-0.311。OBP3蛋白沒有卷曲螺旋結(jié)構(gòu),沒有跨膜區(qū)。OBP3蛋白疏水性指數(shù)最大值為3.244,最小值為-2.944。OBP3蛋白屬于全α型蛋白。OBP3蛋白的信號肽具體序列為MKTI

6、VILLFTLCIVSYMQMVRCD,剪切位點位于第22-23位氨基酸。OBP3蛋白定位于分泌通路。
　　4.本實驗成功構(gòu)建pET-OBP3原核表達(dá)載體,重組子pET-OBP3經(jīng)酶切鑒定及測序,電泳結(jié)果表明酶切可以切出與obp3基因片段長度相等的片段,測序結(jié)果表明序列正確。將重組質(zhì)粒pET-OBP3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)Rosetta(DE3)中進(jìn)行表達(dá),用其表達(dá)的蛋白作為抗原免疫新西蘭大耳兔,獲得兔抗蜜蜂OBP3抗血清