水稻黃單胞菌Hpa1與AvrBs2蛋白調(diào)控植物生長與抗病性的研究.pdf

1、革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌Harpin與Avr蛋白代表Ⅲ型泌出蛋白的不同類型，對致病性與植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)起不同作用。Avr蛋白屬于致病效應(yīng)因子，需要從細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，才能行使致病功能。Harpin蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)子起作用，幫助致病效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位。同時(shí)，無論是Harpin蛋白還是Avr蛋白，對致病性與植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)都有雙重影響，而Harpin蛋白還有促進(jìn)植物生長的作用。對這種多重功能的分子機(jī)制，目前還不完全清楚。本文選用以前了解比較多的H

2、arpin蛋白Hpa1，研究其促進(jìn)植物生長與抗病防衛(wèi)反應(yīng)的分子機(jī)理，探討蛋白結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位對其功能的影響。另外，還研究了水稻黃單胞菌（Xanthomonasoryzae）AvrBs2的致病作用，為今后探討Harpin與Avr蛋白之間的功能關(guān)系提供基礎(chǔ)。
　　1.Hpa1利用乙烯和赤霉素信號(hào)調(diào)控植物生長與生長相關(guān)基因表達(dá)
　　前人研究表明，Harpin通過乙烯信號(hào)及其調(diào)控因子EIN5來促進(jìn)植物生長，這一效應(yīng)主要涉及植物伸展素

3、蛋白(expansin，EXP)的作用。植物EXP構(gòu)成一個(gè)很大的蛋白家族，其成員受不同激素的調(diào)控，松弛細(xì)胞壁、促進(jìn)細(xì)胞伸展，影響植物不同器官或組織的生長。EXP蛋白家族何種成員受何種激素信號(hào)調(diào)控，還不完全清楚。因此，本文研究了水稻白葉枯病菌Hpa1誘導(dǎo)EXP基因表達(dá)與促進(jìn)植物生長的關(guān)系，著重探討乙烯與赤霉素在這個(gè)過程中所起的作用。研究結(jié)果表明，當(dāng)用Hpa1分別處理擬南芥、番茄、煙草和水稻時(shí)，植物的生長速度加快，同時(shí)葉片含氮量、葉綠素含量

4、及葉綠素a和葉綠素b的比率提高。對Hpa1誘導(dǎo)的EXP基因表達(dá)分析結(jié)果顯示:有11個(gè)組織特異性的EXP基因被Hpa1誘導(dǎo)表達(dá)，其中有4個(gè)與Hpa1誘導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)，還有4個(gè)是最新鑒定的在煙草或水稻葉片中特異表達(dá)的基因。Hpa1處理能夠誘導(dǎo)乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因的上調(diào)表達(dá)，而阻斷乙烯信號(hào)的響應(yīng)，能夠抑制Hpa1誘導(dǎo)的EXP基因表達(dá)和植物促生長作用。在水稻中，Hpa1誘導(dǎo)EXP基因表達(dá)和促生長效應(yīng)與GA3作用類似，而阻斷赤霉素的生物合成，H

5、pa1誘導(dǎo)的EXP基因表達(dá)和促進(jìn)植物生長的作用也會(huì)被抑制。由此說明，Hpa1誘導(dǎo)EXP基因表達(dá)和促進(jìn)植物生長需要ET和GA信號(hào)的參與。
　　2.Hpa1蛋白生物學(xué)功能行使與促進(jìn)植物生長的作用必需其N-端序列
　　水稻黃單胞茵的Hpa1蛋白，能夠促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物防衛(wèi)反應(yīng)與抗逆性，但機(jī)制還沒研究清楚。已有研究表明，Hpa1N-端氨基酸對其在非寄主煙草上產(chǎn)生HR是必需的。為了研究Hpa1N-端氨基酸對其生物學(xué)功能及植物生長的

6、影響，我們分別構(gòu)建了全長Hpa1和Hpa1N-端缺失突變體的原核表達(dá)載體，得到了全長Hpa1蛋白和缺失N端的Hpa1蛋白(Hpa1ΔNT)。分別用Hpa1和Hpa1ANT處理植物，發(fā)現(xiàn)Hpa1ΔNT喪失了激發(fā)煙草產(chǎn)生HR的能力，同時(shí)也大大減弱了植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)及抗逆性。對植物生長能力的測定結(jié)果表明，Hpa1能夠促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長，但不影響生殖生長;Hpa1處理能增強(qiáng)植物生長相關(guān)基因的表達(dá)和植物葉片細(xì)胞的伸長生長;Hpa1處理能促進(jìn)植物

7、葉片葉的CO2的傳導(dǎo)及光合作用，而Hpa1ΔNT則大大削弱了Hpa1所誘導(dǎo)的促生長效應(yīng)。由此說明，Hpa1N-端對其生物學(xué)功能的行使及促進(jìn)植物生長是必需的。
　　3.質(zhì)外體和細(xì)胞質(zhì)Hpa1對H2O2的產(chǎn)生與抗病性發(fā)揮不同作用
　　革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌分泌的Harpin蛋白能夠激活植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，其中包括Harpin誘導(dǎo)的活性氧爆發(fā)，尤其是質(zhì)外體中H2O2的產(chǎn)生。但是，Harpin蛋白在防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)

8、通路中是如何被識(shí)別的以及產(chǎn)生于植物細(xì)胞質(zhì)外體中的H2O2是如何參與防衛(wèi)反應(yīng)的，目前還不是很清楚。本研究以水稻白葉枯病菌的Harpin蛋白Hpa1為研究對象，解析其亞細(xì)胞定位是否影響了H2O2的產(chǎn)生以及H2O2是如何參與調(diào)控植物抗病性的。分別把Hpa1和融合了質(zhì)外體定位信號(hào)基因(S)的Hpa1（SHpa1）轉(zhuǎn)入擬南芥，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株HETAt(Hpa1-expressingtransgenicArabidopsisthaliana

9、)和SHETAt(SHpa1-expressingtransgenicArabidopsisthaliana)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞茵PstDC3000和大白菜軟腐病菌PccRL4具有抗性。亞細(xì)胞定位顯示，Hpa1定位于HETAt的細(xì)胞質(zhì)及SHETAt的質(zhì)外體和細(xì)胞膜。通過對植物中H2O2的檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2主要積累于HETAt的細(xì)胞質(zhì)及SHETA的質(zhì)外體和細(xì)胞質(zhì)。藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2產(chǎn)生于HETAt的細(xì)胞質(zhì)和SH

10、ETAt的質(zhì)外體，并且產(chǎn)生于質(zhì)外體的H2O2依賴于NOX。外源噴施Hpa1處理野生型擬南芥時(shí)，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)外體并能誘導(dǎo)H2O2在質(zhì)外體產(chǎn)生，且質(zhì)外體H2O2能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。用DPI處理噴施Hpa1的野生型擬南芥和SHETAt植物后，抑制了質(zhì)外體H2O2的產(chǎn)生，且細(xì)胞質(zhì)中H2O2的積累也大大減少，同時(shí)也削弱了植物的抗病能力。以上結(jié)果表明，受Hpa1誘導(dǎo)且在質(zhì)外體產(chǎn)生的H2O2需要從質(zhì)外體運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中才能參與植物防衛(wèi)反應(yīng)過程。

11、>　　4.水稻條斑病菌Ⅲ型效應(yīng)因子AvrBs2的病理功能研究
　　水稻黃單胞茵通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將大量的效應(yīng)因子注入寄主細(xì)胞，使寄主產(chǎn)生抗（感）病性。雖然越來越多的Ⅲ型效應(yīng)蛋白包括Avr蛋白被鑒定出來，但是關(guān)于其蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的研究目前還不是很多。AvrBs2是第一個(gè)被證明能夠增強(qiáng)病原細(xì)菌在寄主植物中繁殖的Ⅲ型效應(yīng)蛋白，能夠增強(qiáng)野油菜黃單胞菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria（Xcv)的毒性

12、，但是高度保守的AvrBs2效應(yīng)因子在其它黃單胞菌中的生物學(xué)功能目前研究的還不是很清楚，尤其是水稻黃單胞菌。本文擬研究Xoc菌株RS105的AvrBs2效應(yīng)因子的蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。通過同源交換，我們獲得了avrBs2xoc基因插入突變體。接種試驗(yàn)結(jié)果表明，avrBs2突變體和野生型雖然在煙草上引起過敏反應(yīng)的能力沒有明顯差異，但突變體卻顯著降低了病原茵在水稻IR24上的致病性，同時(shí)增強(qiáng)了植物病程相關(guān)蛋白基因PR-1a、PR-1b的表達(dá)