水稻黃單胞菌PXO99A抗低氧壓力研究以及三型效應蛋白的發(fā)掘.pdf

1、水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌白葉枯致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)引起的一種破壞性極大的細菌性病害，長期以來對水稻的產量造成巨大的損失。Xoo對宿主水稻的成功侵染不僅依賴各種致病因子的作用，還需要克服在侵染過程中遭遇的各種環(huán)境壓力。研究Xoo的毒力因子和其克服環(huán)境壓力的策略具有重要意義。
　　氧在病原菌與宿主的互作中起重要的作用。研究表明，病原菌在侵染宿主的過程中會誘導宿主局部低氧環(huán)

2、境的產生。Xoo侵染水稻的過程中會誘導維管束內低氧環(huán)境的產生，使Xoo遭遇低氧環(huán)境的脅迫。Xoo是一種好氧細菌，低氧環(huán)境不利于其生長繁殖;另一方面，低氧可作為一種信號被Xoo所感知進而調控自身相關基因的表達以適應低氧環(huán)境并啟動侵染相關的機制。
　　為研究Xoo在低氧脅迫下的應對策略，本課題以Xoo PXO99A為研究對象探索Xoo在低氧不利條件下的生長、代謝和致病因子的表達調控變化。首先我們對低氧和常氧兩種條件下培養(yǎng)的PXO99A

3、總蛋白進行提取和鑒定。對兩種條件下的蛋白質進行比較分析發(fā)現在常氧和低氧條件下分別有187和140個蛋白質被特異檢測到。通過WEGO(Web Gene Ontology Annotation Plot)對這些常氧和低氧條件下特異檢測到的蛋白質進行GO(Gene Ontology)功能分類，可分別分為34和32類。GO富集(GO enrichment)分析發(fā)現常氧條件下被特異檢測到的蛋白質主要富集在趨化性和細胞壁合成相關途徑，而低氧條件下被

4、特異檢測到的蛋白質主要富集在芳香族氨基酸合成相關途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析顯示常氧和低氧條件下被特異檢測到的蛋白質分別參與到48和64條代謝途徑中，其中分別有17和33條代謝途徑是低氧和常氧條件下所特有的。低氧條件下所特有的代謝通路有糖酵解/糖異生、蛋白質運輸、丙酸代謝和丁酸代謝等途徑。
　　跟據以上分析，我們選取了15個在低氧條件下被特異檢測到的蛋白質

5、研究Xoo在適應低氧條件下的毒力機制。選取的15個蛋白可分別參與到細菌粘附、芳香族氨基酸合成、糖酵解、丁酸或丙酸代謝相關途徑中。通過同框缺失敲除對15個蛋白的編碼基因進行敲除得到10個同框缺失突變體。以敏感水稻MH63為靶標對缺失突變體的致病力進行檢測發(fā)現乙酰酯合成酶2催化亞基蛋白PXO_02606功能缺失時導致致病力喪失，而葡糖激酶PXO_00609和F5/8 type C結構域蛋白PXO_01697功能缺失時導致致病力下降。進一步的

6、實驗發(fā)現，PXO_02606的同框缺失突變體在貧瘠培養(yǎng)基XOM2中表現出生長缺陷，其致病力喪失是因為生長缺陷造成的。對PXO_00609和PXO_01697的功能進行初步探索發(fā)現，PXO_00609的缺失導致胞外多糖(EPS)產量和運動能力相對野生型菌株明顯減弱。以上結果表明，在低氧條件下Xoo通過PXO_00609促進EPS的合成和細菌的擴散進而促進其感染。PXO_01697由N端信號肽、F5/8 type C和AfuC(Alpha-

7、L-fucosidase)保守結構域三部分組成。AfuC結構域屬于巖藻糖苷酶超家族，與碳水化合物的代謝和運輸相關。F5/8 type C可與脂質、多糖和蛋白質相互作用并參與到細胞的粘附中。粘附作用是病原菌侵染宿主的關鍵步驟，粘附因子可被宿主識別而引起宿主的初級免疫反應PTI（PAMP-triggered immunity）反應。利用農桿菌在煙草葉片上瞬時表達PXO_01697發(fā)現其可以在引起非宿主植物煙草上引起PTI反應。因此，我們認為