水稻黃單胞菌PXO99A抗低氧壓力研究以及三型效應(yīng)蛋白的發(fā)掘.pdf

1、水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌白葉枯致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)引起的一種破壞性極大的細(xì)菌性病害，長期以來對(duì)水稻的產(chǎn)量造成巨大的損失。Xoo對(duì)宿主水稻的成功侵染不僅依賴各種致病因子的作用，還需要克服在侵染過程中遭遇的各種環(huán)境壓力。研究Xoo的毒力因子和其克服環(huán)境壓力的策略具有重要意義。
　　氧在病原菌與宿主的互作中起重要的作用。研究表明，病原菌在侵染宿主的過程中會(huì)誘導(dǎo)宿主局部低氧環(huán)

2、境的產(chǎn)生。Xoo侵染水稻的過程中會(huì)誘導(dǎo)維管束內(nèi)低氧環(huán)境的產(chǎn)生，使Xoo遭遇低氧環(huán)境的脅迫。Xoo是一種好氧細(xì)菌，低氧環(huán)境不利于其生長繁殖;另一方面，低氧可作為一種信號(hào)被Xoo所感知進(jìn)而調(diào)控自身相關(guān)基因的表達(dá)以適應(yīng)低氧環(huán)境并啟動(dòng)侵染相關(guān)的機(jī)制。
　　為研究Xoo在低氧脅迫下的應(yīng)對(duì)策略，本課題以Xoo PXO99A為研究對(duì)象探索Xoo在低氧不利條件下的生長、代謝和致病因子的表達(dá)調(diào)控變化。首先我們對(duì)低氧和常氧兩種條件下培養(yǎng)的PXO99A

3、總蛋白進(jìn)行提取和鑒定。對(duì)兩種條件下的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)在常氧和低氧條件下分別有187和140個(gè)蛋白質(zhì)被特異檢測(cè)到。通過WEGO(Web Gene Ontology Annotation Plot)對(duì)這些常氧和低氧條件下特異檢測(cè)到的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能分類，可分別分為34和32類。GO富集(GO enrichment)分析發(fā)現(xiàn)常氧條件下被特異檢測(cè)到的蛋白質(zhì)主要富集在趨化性和細(xì)胞壁合成相關(guān)途徑，而低氧條件下被

4、特異檢測(cè)到的蛋白質(zhì)主要富集在芳香族氨基酸合成相關(guān)途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析顯示常氧和低氧條件下被特異檢測(cè)到的蛋白質(zhì)分別參與到48和64條代謝途徑中，其中分別有17和33條代謝途徑是低氧和常氧條件下所特有的。低氧條件下所特有的代謝通路有糖酵解/糖異生、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、丙酸代謝和丁酸代謝等途徑。
　　跟據(jù)以上分析，我們選取了15個(gè)在低氧條件下被特異檢測(cè)到的蛋白質(zhì)

5、研究Xoo在適應(yīng)低氧條件下的毒力機(jī)制。選取的15個(gè)蛋白可分別參與到細(xì)菌粘附、芳香族氨基酸合成、糖酵解、丁酸或丙酸代謝相關(guān)途徑中。通過同框缺失敲除對(duì)15個(gè)蛋白的編碼基因進(jìn)行敲除得到10個(gè)同框缺失突變體。以敏感水稻MH63為靶標(biāo)對(duì)缺失突變體的致病力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乙酰酯合成酶2催化亞基蛋白PXO_02606功能缺失時(shí)導(dǎo)致致病力喪失，而葡糖激酶PXO_00609和F5/8 type C結(jié)構(gòu)域蛋白PXO_01697功能缺失時(shí)導(dǎo)致致病力下降。進(jìn)一步的

6、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PXO_02606的同框缺失突變體在貧瘠培養(yǎng)基XOM2中表現(xiàn)出生長缺陷，其致病力喪失是因?yàn)樯L缺陷造成的。對(duì)PXO_00609和PXO_01697的功能進(jìn)行初步探索發(fā)現(xiàn)，PXO_00609的缺失導(dǎo)致胞外多糖(EPS)產(chǎn)量和運(yùn)動(dòng)能力相對(duì)野生型菌株明顯減弱。以上結(jié)果表明，在低氧條件下Xoo通過PXO_00609促進(jìn)EPS的合成和細(xì)菌的擴(kuò)散進(jìn)而促進(jìn)其感染。PXO_01697由N端信號(hào)肽、F5/8 type C和AfuC(Alpha-

7、L-fucosidase)保守結(jié)構(gòu)域三部分組成。AfuC結(jié)構(gòu)域?qū)儆趲r藻糖苷酶超家族，與碳水化合物的代謝和運(yùn)輸相關(guān)。F5/8 type C可與脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)相互作用并參與到細(xì)胞的粘附中。粘附作用是病原菌侵染宿主的關(guān)鍵步驟，粘附因子可被宿主識(shí)別而引起宿主的初級(jí)免疫反應(yīng)PTI（PAMP-triggered immunity）反應(yīng)。利用農(nóng)桿菌在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)PXO_01697發(fā)現(xiàn)其可以在引起非宿主植物煙草上引起PTI反應(yīng)。因此，我們認(rèn)為