三種Ⅲ型蛋白影響黃單胞菌—水稻互作與植物抗病性研究.pdf

1、利用24個(gè)已知抗病基因的近等基因系材料對(duì)我國(guó)285個(gè)水稻白葉枯菌株的毒性進(jìn)行了研究。除了IRBB51以外，含有多個(gè)抗病基因的水稻品種幾乎對(duì)所有菌株都表現(xiàn)了高度的抗性。因此，我們選出對(duì)白葉枯菌株抗感反應(yīng)有明顯差異的13個(gè)含有單個(gè)抗病基因的水稻品種用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。IR24和IRBB10抗性很弱，僅對(duì)少數(shù)菌株具有抗性；而IRBB5、IRBB7以及IRBB21則具有較高的抗性，對(duì)大多數(shù)菌株表現(xiàn)出高度的抗性。其它單基因品種如IRBB2、IRBB

2、3、IRBB4、IRBB7、IRBBl3等在菌株間的抗感反應(yīng)有著顯著的差異。因此，根據(jù)白葉枯病菌與近等基因系水稻之間的互作，我們篩選出6個(gè)單基因品種0m385，IRBB13，IRBB3，IRBB14，IRBB2，IR24)作為鑒別品種，從而將我國(guó)的白葉枯病菌菌株劃分為9個(gè)小種，其互作模式依次為：RRRRRR、RRRRRS，RRRRSS，RRRSSS，RRSSSS，RSRRRS，RSSRRS，RSSSSS，SSSSSS，對(duì)應(yīng)小種頻率分別為

3、10.18％、10.53％、4.91％、10.18％、24.21％、5.96％、11.23％、22.46％、0.35％。我國(guó)白葉枯菌株的毒性呈現(xiàn)多樣性，不同時(shí)期、不同地區(qū)菌株毒性差異明顯。與菲律賓菌株的毒性進(jìn)行比較，也存在較大的差異。 通過(guò)構(gòu)建Xanthomonas oryzae pv，oryzae PXO99的hrpA、hrpF基因突變菌株 PXO99/PMD-A(AOS)、PXO99/PMD-F(FOS)及其功能互補(bǔ)菌株AO

4、S/pUFR034：：hrpA (cAOS)、FOS/pUFR034：：hrpF(cFOS)，并分別對(duì)之進(jìn)行GFP熒光標(biāo)記，產(chǎn)生 PXO99/pHM1：：gfp(PXO99-GFP)、AOS/pHM1：：gap(AOS-GFP)、FOS/pHM1：：gfp(FOS-GFP)、AOS/pHMl：：hrpA：：gfp(cAOS-GFP)、FOS/pHMl：：hrpF：：gfp(cFOS-GFP)，對(duì)水稻-白葉枯病菌互作進(jìn)行研究。用PXO99

5、、AOS、FOS、cAOS、cFOS、PX099-GFP、AOS-GFP、FOS-GFP、cAOS-GFP、cFOS-GFP分別處理水稻及煙草。GFP標(biāo)記菌株與非GFP標(biāo)記菌株對(duì)水稻的致病性及在煙草上形成HR的能力沒(méi)有明顯差別。突變體FOS對(duì)水稻的致病性減弱，AOS幾乎完全喪失了對(duì)水稻的致病性，形成褐斑。FOS仍然具有誘導(dǎo)煙草形成HR的能力，而AOS同時(shí)喪失了在煙草上形成HR的能力。功能互補(bǔ)菌株cAOS、cFOS對(duì)水稻的致病性比突變體有

6、所恢復(fù)，但達(dá)不到野生型的水平。 cAOS不能恢復(fù)AOS在煙草上形成HR的能力，cFOS仍然可誘導(dǎo)煙草葉片形成HR。病原菌噴霧處理水稻葉片的熒光觀察顯示，野生型菌株、功能互補(bǔ)菌株、突變體FOS-GFP通過(guò)傷口及自然孔口形成侵染，而突變體AOS不能形成侵染。電鏡觀察結(jié)果表明，野生型菌株多數(shù)以聚集的方式吸附在自然孔口周?chē)?，而突變菌株AOS則多數(shù)以分散的形式吸附于水稻葉片表面。以上結(jié)果顯示，hrpA的突變可能對(duì)菌株的識(shí)別及聚集能力產(chǎn)生了

7、影響，從而影響了菌株的侵染。已有研究試圖確定harpins在植物細(xì)胞中的作用部位。但對(duì)不同的harpins如來(lái)自 Erwinia amylovora的HrpN<,Ea>、Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的HrpN<,psph>等研究結(jié)果都不盡相同。因此，harpins的識(shí)別部位、結(jié)合受體等一直不清楚，在本研究中，作者利用熒光蛋白標(biāo)記構(gòu)建融合蛋白，以便今后進(jìn)一步研究HrpA. HrpF在水稻上的作用

8、部位。HrpA<,Xoo>、HrpF<,Xoo>和HrpA<,Xooc>、HrpF<,Xooc>分別是由水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的hrpA、hrpF基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。從水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌中分別克隆hrpA和hrpF基因，與gfp(green fluorescent protein)構(gòu)建融合基因，連接pET30a(+)載體，獲得了重組質(zhì)粒pET30a(+)：：hrpA<,Xoo>：：gfp、pET30a(+)

9、：：hrpA<,Xooc>：：gfp、 pET30a(+)：：hrpF<,Xoo>：：gfp和pET30a(+)：：hrpF<,Xooc>：：gfp，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)產(chǎn)生表達(dá)菌株pAGGE、pARGE、pFGGK和pFRGK。表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，超聲波破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別產(chǎn)生94.6 kD、94.8 kD、116.3 kD、116.3 kD大小的組氨酸標(biāo)記的目的蛋白質(zhì)與GFP

10、的融合蛋白條帶。 水稻細(xì)菌性條斑病菌HpaG<,Xooc>蛋白質(zhì)作為harpin效應(yīng)分子可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)植物對(duì)病原菌的抗病性。其編碼基因hpaG<,Xooc>包含兩個(gè)富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域(glycine-rich motif,GRM)和一個(gè)半胱氨酸(cysteine)。GRM是harpin類蛋白的共同特征，而一般harpin類蛋白結(jié)構(gòu)中則不含有半胱氨酸。我們對(duì)hpaG<,Xooc>的GRM進(jìn)行了缺失突變得到

11、突變體hpaG<,Xooc>MG(MG)，對(duì)hpaG<,Xooc>的半胱氨酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其半胱氨酸突變成蘇氨酸得到突變體hpaG<,Xooc>C47T(C47T)。hpaG<,Xooc>、MG、C47T經(jīng)體外表達(dá)得到HpaG<,Xooc>、MG和C47T。用它們分別處理煙草，MG和C47T誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生的死亡細(xì)胞數(shù)目分別是HpaG<,XooC>的1.7和1.2倍；標(biāo)記基因hin1、hsr203的表達(dá)結(jié)果與之一致。MG和C47T處理

12、的植株的抗病性也明顯增強(qiáng)。以HpaG<,Xoo>、MG、C47T處理的煙草再接種病斑TMV病毒，5天后調(diào)查，三種蛋白處理的植株葉片病斑分別減少了58％、92％、81％；以Pseudomonas syringae pv.tomato(DC3000)接種番茄，5天內(nèi)對(duì)病原菌進(jìn)行持續(xù)分離，統(tǒng)計(jì)其細(xì)胞數(shù)目。經(jīng)HpaG<,Xooc>、MG、C47T處理的番茄上的病原菌的數(shù)目分別約為對(duì)照的1/160、1/15860、1/1260。防衛(wèi)相關(guān)基因Chi

13、a5、NPR1、PR-1a的表達(dá)結(jié)果與之一致。HpaG<,Xooc>、MG和C47T還可促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，地上部分的增長(zhǎng)幅度分別為15％、46％、125％、；地下部分的增長(zhǎng)幅度分別為53％、106％、77％。細(xì)胞延展與生長(zhǎng)相關(guān)基因EXP2的表達(dá)情況與之一致。這些結(jié)果說(shuō)明HpaG<,Xooc>中富含甘氨酸的區(qū)域以及半胱氨酸的存在抑制了蛋白本身對(duì)植物的效應(yīng)。 HpaG<,Xooc>、HrpF<,Xooc>、HrpA<,Xooc>作為水稻細(xì)菌性條

14、斑病菌的Ⅲ型蛋白，與病原菌的致病性密切相關(guān)。HpaG<,Xooc>作為效應(yīng)分子，HrpF<,Xooc>參與病原菌Ⅲ型泌出系統(tǒng)通過(guò)寄主植物的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)的形成。HrpA<,Xooc>可能參與病原菌Ⅲ型泌出系統(tǒng)的泌出結(jié)構(gòu)的形成。三者之間是否存在某種關(guān)系呢?通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)探討Ⅲ型蛋白HrpAXooc、 HrpFXooc與HpaGXooc之間的關(guān)系。分別構(gòu)建AD載體pGADT7：：hrpA<,Xooc>、 pGADT7：：hrpF<,Xooc>

15、和DNA-BD載體pGBKT7：：hpaG<,Xooc>、pGBKT7：：MG、pGBKT7：：C47T. AD載體與DNA-BD載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y190，β-Galactosidase Assays顯色表明， HrpA<,Xooc>、HrpF<,Xooc>與HpaG<,Xooc>、MG、C47T之間不存在直接的互作。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：(1)通過(guò)突變體闡釋Ⅲ型蛋白HrpA和HrpF在水稻-黃單胞菌互作中的功能；(2)通過(guò)對(duì)Hp