對蝦白斑綜合征病毒細菌人工染色體基因組的構建研究.pdf

1、上海海洋大學碩士學位論文 學 校 代 碼 ： 1 0 2 6 4研究生學號： M100208351上 海 海 洋 大 學 碩 士 學 位 論 文學 碩 士 學 位 論 文 題 目： 目：對蝦白斑綜合征病毒細菌人工染色體基因組 對蝦白斑綜合征病毒細菌人工染色體基因組 的構建研究 的構建研究 英文題目： 英文題目：Cloning the genomic DNA of white spot syndrome virus as bact

2、erial artificial chromosome 專 業(yè)： 業(yè)：食品科學與工程 食品科學與工程 研究方向： 研究方向：分子病毒學 分子病毒學 姓 名： 名：馮博 馮博 指導教師： 指導教師：王永杰 王永杰 教授 教授 二〇一三年四月十日 二〇一三年四月十日 上海海洋大學碩士學位論文 對蝦白斑綜合征病毒細菌人工染色體基因組的構建研究 摘 要 對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, W

3、SSV)是對蝦最主要的病原體之一， 可在短時間內造成對蝦大規(guī)模的死亡。 自上世紀九十年代初在臺灣北部發(fā)現(xiàn)以來， WSSV 已經(jīng)擴散至世界各地， 對全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 由于缺乏連續(xù)培養(yǎng) WSSV 的細胞株及其基因組 DNA 體外克隆操作系統(tǒng)，WSSV 病毒學特性的研究進展緩慢。本研究嘗試著通過構建 WSSV 的細菌人工染色體基因組 DNA (WSSV::BAC)，建立病毒基因組 DNA 體外克隆系統(tǒng)，為研究病毒基因的功能

4、， 特別是在病毒經(jīng)口侵染對蝦過程中發(fā)揮關鍵作用的蛋白功能提供一個思路。WSSV::BAC 的構建基于含有 mini-F 因子的轉座子。通過體外轉座反應插入到 WSSV 基因組 DNA 后，使得病毒基因組 DNA 可以在大腸桿菌中以單拷貝的形式復制。同時，轉座子還攜帶有氯霉素抗性基因。經(jīng)含有氯霉素的選擇性培養(yǎng)基初步篩選之后，再通過 WSSV 特異性 PCR 擴增和菌落原位雜交相結合的方法進一步篩選，以期獲得含有 WSSV::BAC 的陽性

5、克隆。 為了解決因病毒基因組過大可能會導致克隆成功率過低的問題， 本文①采用了電轉化的方式，②以可接收外源大片段 DNA 的電轉化感受態(tài) E. coli DH10B為受體細胞，③增加了轉座反應體系中 WSSV 基因組 DNA 和轉座子的摩爾數(shù)，④降低了轉座反應體系中離子濃度，⑤延長了電擊時間。結果表明，轉座成功率得到提高，并獲得了較多的陽性克隆子。 研究中以 WSSV vp26 基因為靶標設計了 WSSV 特異性的引物和探針。 通過菌落

6、 PCR 和菌落原位雜交技術， 篩選含有 WSSV::BAC 的陽性克隆子。 菌落 PCR結果表明，在篩選的 1452 個克隆中，部分克隆傳代前可以獲得陽性信號，傳代后卻檢測不到陽性信號，同時也提取不到 WSSV::BAC。菌落原位雜交結果初步表明，在已篩選的 400 個克隆中，尚未找到穩(wěn)定的陽性克隆。 本文的研究雖未獲得可穩(wěn)定遺傳的 WSSV::BAC，但通過后續(xù)深入的分析和進一步的研究，有望構建出對蝦白斑綜合征病毒的細菌人工染色體基