雞馬立克氏病病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek's disease,MD)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一.該病以T淋巴細(xì)胞增生性腫瘤、高度接觸性傳染以及造成雞的嚴(yán)重免疫抑制為特征,其病原為雞馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV),該病毒屬皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科雙鏈DNA病毒,基因組大約180kb.根據(jù)抗原性不同,馬立克氏病病毒(MDV)可分為3種血清型,血清1型包括所有致瘤的馬立克氏病病毒,含強(qiáng)毒及其致弱的變異毒株;而血清2型

2、包括所有不致瘤的馬立克氏病病毒:血清3型包括所有的火雞皰疹病毒 (Herpesvirus of turkey,HVT) 及其變異毒株. 由于MDV是嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合病毒,對(duì)MDV基因組進(jìn)行基因操作和研究十分困難.近幾年細(xì)菌人工染色體技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題.首先構(gòu)建MDV細(xì)菌人工染色體(BAC),然后利用分子克隆化病毒BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,啟動(dòng)病毒感染,產(chǎn)生純系重組病毒.BAC分子克隆化病毒服從大腸桿菌基因操作技術(shù),在大腸桿

3、菌中可以對(duì)其進(jìn)行方便的基因操作和研究.尤其是利用近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代DNA克隆技術(shù)--RED/ET技術(shù),它可以在細(xì)菌中對(duì)病毒基因組實(shí)施快速有效的各種修飾(刪除、插入和點(diǎn)突變),甚至對(duì)病毒基因組的必需基因進(jìn)行有效的突變. 本研究的目的是構(gòu)建雞馬立克氏病病毒814株全基因組感染性分子克隆化病毒一細(xì)菌人工染色體,建立雞馬立克氏病病毒的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái).首先利用自主構(gòu)建的表達(dá)Eco-gpt的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移遺傳選擇標(biāo)記(1.3

4、kb)和帶有細(xì)菌人工染色體(Bacterial ArtificialChromosomes,BAC)基本基因功能序列(pBeloBAC11,7.5kb)成功構(gòu)建了雞馬立克氏病病毒重組病毒轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BACll,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將轉(zhuǎn)移載體與馬立克氏病病毒感染CEF細(xì)胞的總DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞,啟動(dòng)病毒感染后,在選擇培養(yǎng)基的遺傳選擇加壓條件下,經(jīng)八輪篩選、富集并完全純化了重組病毒:適時(shí)提取環(huán)化重組病毒感染CEF細(xì)胞的

5、總DNA,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切圖譜、凝膠電泳和PCR鑒定BAC分子克隆化病毒,經(jīng)鑒定獲得了38個(gè)BAC分子克隆化病毒,并且用編號(hào)為MDV-BAC2的克隆提取純化的BAC-DNA轉(zhuǎn)染次代CEF細(xì)胞,再次啟動(dòng)了病毒感染,產(chǎn)生了MDV特異性病毒蝕斑,拯救出了重組病毒;進(jìn)一步研究表明重組病毒 rv-MDV814、野生病毒 wt-MDV814與拯救的重組病毒BAC-redrived MDV814三種病毒在體外雞胚成纖維細(xì)胞

6、上的生物學(xué)特性相似;進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)研究表 rv-MDV 814、 BAC2-derived MDV 814、PBS-BAC2-DNA、LiD-BAC2-DNA、Ca-BAC2-DNA、活菌-BAC2免疫雞部分能夠抵抗 J-1 株強(qiáng)毒的攻擊,表明BAC-based疫苗具有作為預(yù)防雞馬立克氏病新型疫苗進(jìn)行開(kāi)發(fā)的潛力.本研究為進(jìn)一步研究雞馬立克氏病病毒的致瘤機(jī)制、潛伏機(jī)制和基因功能提供了很好遺傳操作技術(shù)平臺(tái),添補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白,同時(shí)也為以馬立克