中國對蝦血細胞發(fā)生、功能及其白斑綜合征病毒受體蛋白研究.pdf

1、本論文在研制的抗中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細胞單克隆抗體的基礎上，通過間接免疫熒光技術首次檢測到中國對蝦血細胞最早出現(xiàn)于肢芽期，大顆粒細胞最早出現(xiàn)于膜內(nèi)無節(jié)幼體期；通過流式細胞技術研究發(fā)現(xiàn)，中國對蝦血細胞對熒光微球的吞噬率在注射后迅速升高并在6h后達到最高值，被吞噬的熒光微球在淋巴器官中積累，血細胞吞噬率在白斑綜合征病毒(WSSV)感染后雖在短時間內(nèi)升高但隨后迅速降低；論文建立了差速離心法提取的中國對

2、蝦血細胞膜與地高辛標記WSSV的Dot-Blot和ELISA體外結(jié)合體系作為篩選體系，從制備的中國對蝦血細胞膜單克隆抗體中篩選到一株對WSSV具有阻斷作用的單克隆抗體R2H1，為進一步研究WSSV與宿主的相互作用機理提供了基礎。 (1)利用雜交瘤技術，論文制備了特異性識別中國對蝦所有三類血細胞的單抗2A3和特異性識別中國對蝦大顆粒血細胞中細胞質(zhì)顆粒的單抗1H11。通過對包括囊胚期、原腸胚期、肢芽期、膜內(nèi)無節(jié)幼體期和無節(jié)幼體Ⅰ期在

3、內(nèi)的中國對蝦胚胎的間接免疫熒光檢測，最早在肢芽期胚胎中檢測到2A3陽性信號；在膜內(nèi)無節(jié)幼體期，2A3陽性血細胞平均直徑約7μm，聚集成簇；在無節(jié)幼體Ⅰ期，血細胞形態(tài)更加完整清晰，平均直徑已與成體對蝦血細胞相似。1H11陽性大顆粒細胞最早在膜內(nèi)無節(jié)幼體期胚胎中出現(xiàn)，這些細胞同樣成簇存在，在其細胞質(zhì)外圍可見點狀熒光。在無節(jié)幼體Ⅰ期樣品中，血細胞總數(shù)和大顆粒細胞數(shù)量較胚胎期都顯著增加，反映了對蝦免疫系統(tǒng)隨著胚胎發(fā)育的進行而加強。 (2

4、)流式細胞術分析顯示，健康中國對蝦血細胞對注射入體內(nèi)的熒光微球的吞噬在注射后迅速升高并在6h后達到最高點12.58％；隨后該比率逐漸下降，至注射后16h實驗結(jié)束時，血細胞吞噬率已下降到4.02％，反映了血細胞對血淋巴中異物的清除過程。顯微鏡觀察注射微球6h后中國對蝦的外周血細胞和淋巴器官，發(fā)現(xiàn)主要是半顆粒細胞執(zhí)行對微球的吞噬，吞噬后的熒光微球在淋巴器官中積累。WSSV感染后第一天，血細胞吞噬率(14.42％)由于應激作用而略高于對照值；

5、隨后，該比率迅速降低并維持在對照值的50％左右(6.12％)；在感染后第六天，血細胞吞噬率再次上升至11.23％，隨后感染對蝦大量死亡。 (3)論文通過差速離心法提取海捕中國對蝦血細胞膜，分別利用Dot-Blot和ELISA技術，使地高辛(DIG)標記的WSSV與之4℃結(jié)合4h并以抗DIG抗體作為探針檢測，實驗結(jié)果皆為陽性，證明體外環(huán)境下WSSV能穩(wěn)定地與血細胞膜結(jié)合。以抗中國對蝦血細胞膜多克隆抗體37℃孵育血細胞膜1h，能夠阻