菊苣DREB1家族基因的分離和表達(dá)分析及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、本研究從菊苣中分離克隆了逆境脅迫誘導(dǎo)的兩個(gè)DREB1轉(zhuǎn)錄因子-CiDREB1A和CiDREB1B，并進(jìn)一步研究了全生育期非逆境脅迫下的CiDREB1A和CiDREB1B的時(shí)空表達(dá)模式以及逆境脅迫條件下菊苣CiDREB1A和CiDREB1B的誘導(dǎo)表達(dá)模式;然后通過亞細(xì)胞定位表達(dá)系統(tǒng)和酵母單雜交表達(dá)系統(tǒng)初步驗(yàn)證了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能;同時(shí)研究了培養(yǎng)基和激素的不同配比對普那菊苣離體再生影響的研究，建立起了普那菊苣穩(wěn)定高效的離體再生體系。本研究

2、為深入探索菊苣的抗逆機(jī)理提供了參考依據(jù)，為進(jìn)一步發(fā)掘菊苣抗逆基因和菊苣的品種改良奠定了工作基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過生物信息學(xué)中的電子克隆技術(shù)，利用其它物種已有的DREB1的編碼序列到菊苣EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過將篩選到的EST序列進(jìn)行拼接，獲得了兩條包含ORF全長的EST序列并設(shè)計(jì)特異引物，從菊苣中克隆得到兩個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子CiDREB1A和CiDREB1B，登錄號分別為:KC801338和KC811151。這兩個(gè)

3、轉(zhuǎn)錄因子的ORF全長分別為699bp和669bp，分別編碼232和222個(gè)氨基酸。同源序列比對表明，克隆得到的菊苣的CiDREB1A和CiDREB1B具有一個(gè)保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域和核定位信號NLS，并且與經(jīng)過功能驗(yàn)證的菊花中的DgDREB1A和DgDREB1B基因具有很高的相似性。全生育期非逆境脅迫下的時(shí)空表達(dá)模式分析表明CiDREB1A和CiDREB1B只有在菊苣生長的幼苗時(shí)期有相對高的表達(dá)量，之后表達(dá)量逐漸下降。逆境脅迫下

4、的CiDREB1A和CiDREB1B在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達(dá)量變化表明，這兩個(gè)基因在6h受4℃低溫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但同時(shí)它們的相對表達(dá)量也受干旱的輕微誘導(dǎo);這表明CiDREB1A和CiDREB1B主要參與菊苣低溫逆境脅迫誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.構(gòu)建的CiDREB1A-GFP和CiDREB1B-GFP融合蛋白表達(dá)栽體通過基因槍法已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，然后利用共聚焦顯微鏡觀察，確定CiDREB1A和CiDREB1B確實(shí)是定位在細(xì)胞核

5、里，說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是核蛋白。酵母單雜交試驗(yàn)表明只有轉(zhuǎn)化進(jìn)去pGADT7-AD-CiDREB1A、pGADT7-AD-CiDREB1B的酵母菌株，才能夠在含有10mmol/L3-AT的SD/-His的篩選培養(yǎng)基上生長。這表明CiDREB1A和CiDREB1B轉(zhuǎn)錄因子的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域具有和DRE順式作用元件特異性結(jié)合的能力，初步證實(shí)了CiDREB1A和CiDREB1B具有DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能。
　　3.通過對培養(yǎng)基和激

6、素的不同配比對普那菊苣離體再生頻率影響的研究，建立起了普那菊苣的離體高效再生體系。普那菊苣葉片在MS基本培養(yǎng)中添加了1.5mg/L6-BA和0.2mg/LIBA的激素組合，能得到最佳的愈傷誘導(dǎo)率和芽分化率;分化芽在添加了0.1mg/L的NAA的1/2MS培養(yǎng)基中，能得到最佳的生根率。初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)AlNHX1基因轉(zhuǎn)化普那菊苣葉片的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而驗(yàn)證了農(nóng)桿菌介導(dǎo)普那菊苣葉片轉(zhuǎn)化的適宜條件為:預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d，農(nóng)桿菌懸浮液的OD6