草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗微囊制備與口服免疫效果研究.pdf

1、草魚出血病是我國(guó)養(yǎng)殖草魚最為嚴(yán)重的病毒性疾病,其病原為草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)。草魚出血病流行范圍廣,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),死亡率高,對(duì)草魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此,研究草魚出血病的有效防治措施對(duì)草魚養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。疫苗免疫是預(yù)防草魚出血病最為有效的方法,目前,草魚主要以注射免疫或浸泡免疫為主。口服疫苗免疫接種方便,不受魚體大小、養(yǎng)殖規(guī)模等條件限制,越來(lái)越受到

2、研究人員關(guān)注。但是,口服疫苗因疫苗抗原蛋白易受消化系統(tǒng)酶的破壞,而導(dǎo)致其研究與應(yīng)用受到限制。疫苗微囊化技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,降低了疫苗抗原的損失,提高了疫苗的免疫效果,因此,微囊疫苗的研究逐漸受到重視。
　　本研究以海藻酸鈉、殼聚糖為微囊壁材,以草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗為微囊芯材,采用復(fù)凝聚法研究了海藻酸鈉-殼聚糖(SA-CS)微囊疫苗的制備工藝。首先,通過(guò)單因素試驗(yàn),研究了海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、氯化鈣濃度、殼聚糖溶液pH以及加

3、入疫苗體積五個(gè)因素對(duì)微囊疫苗包封率的影響。然后,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)篩選,優(yōu)化了草魚出血病口服微囊疫苗的制備工藝,并確定其最佳制備工藝;最后,通過(guò)微囊疫苗的外觀觀察和體外釋放試驗(yàn),研究了微囊疫苗的外觀形態(tài)、釋放性能以及耐酸堿性能。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示,在制備SA-CS微囊疫苗時(shí),海藻酸鈉濃度宜保持在1.5％左右,殼聚糖濃度宜保持在1%左右,殼聚糖溶液pH宜保持在4-5之間,氯化鈣濃度宜保持在4%左右,最適加入疫苗體積為2mL

4、;正交試驗(yàn)篩選結(jié)果顯示,各因素對(duì)草魚出血病微囊疫苗包封率的影響程度由大到小依次為:海藻酸鈉濃度>疫苗加入量>殼聚糖濃度>氯化鈣濃度,制備草魚出血病微囊疫苗的最佳工藝為:海藻酸鈉濃度1.5%,殼聚糖濃度1%,氯化鈣濃度4%,加入疫苗體積2mL;微囊疫苗體外性能研究顯示,光鏡下觀察微囊呈類圓形,平均粒徑為(7.02±3.95)μm,平均包封率為60.53%,平均載蛋白量為8.12mg/g,在pH7.4的PBS溶液、生理鹽水溶液中具有良好的釋

5、放性能。
　　將保存不同時(shí)間的SA-CS微囊疫苗分別口服免疫草魚,通過(guò)檢測(cè)血清中和抗體效價(jià),研究該微囊疫苗的穩(wěn)定性;經(jīng)過(guò)魚體免疫,以間接熒光免疫技術(shù)證實(shí)該疫苗能夠被草魚腸道攝取;免疫草魚后,在不同時(shí)間點(diǎn)分別取草魚的血液和內(nèi)臟組織(肝、脾、腎),通過(guò)檢測(cè)血清中和抗體效價(jià),比較微囊免疫組、細(xì)胞疫苗口服組和對(duì)照組血清抗體效價(jià)水平的差異,并采用實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量法檢測(cè)草魚免疫相關(guān)基因IgM、Mx的表達(dá)量差異,從而確定該微囊疫苗的免疫效果;通

6、過(guò)草魚呼腸孤病毒GCRV104攻毒試驗(yàn),確定該微囊疫苗的免疫保護(hù)力。SA-CS微囊疫苗穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月的SA-CS微囊疫苗在免疫草魚后,3個(gè)組的血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明微囊疫苗可在4℃條件下保存6個(gè)月;免疫草魚后,血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示,在第7d,免疫組抗體水平顯著上升,細(xì)胞疫苗口服組的抗體水平(83.61±11.02)顯著高于SA-CS微囊疫苗組(69.72±2.37)(P

7、<0.05);在第14d,免疫組均維持在較高的水平,差異不顯著(P>0.05);第21d時(shí),SA-CS微囊疫苗組(101.56±4.28)顯著高于細(xì)胞疫苗組(79.89±9.04)(P<0.05)。免疫相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫組IgM在免疫7d后,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而在第14d后,差異極顯著(P<0.01);而Mx表達(dá)量在免疫3d后顯著高于對(duì)照組(P<0.05),第7d后,差異極顯著(P<0.01)。攻毒試驗(yàn)研究結(jié)果