廣東TTSuVs流行病學(xué)調(diào)查與TTSuV2 ORF1抗原性分析.pdf

1、輸血傳播病毒(Transfusiontransmittedvirus，TTV）是一種小的，無(wú)囊膜的，單股環(huán)狀負(fù)鏈的人畜共患DNA病毒，TTV的發(fā)現(xiàn)是于1997年底由NiShizawa運(yùn)用代表性差異分析技術(shù)(Representationaldifferenceanalysis)從一名非甲一庚型肝炎病人的血清中克隆得到的病毒DNA片段，隨后，人們?cè)诜庆`長(zhǎng)類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了TTV的感染。豬源TTV(

2、TTSuVs)在世界范圍內(nèi)廣泛檢出，引起人們的極大關(guān)注。目前TTSuVs的診斷主要依賴DNA的檢測(cè)，由于豬源TTV具有潛在的危害，因此對(duì)其抗原性進(jìn)行分析是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)將TTSuV2ORF2基因克隆至原核表達(dá)系統(tǒng)中，制備獲得了具有生物學(xué)活性的重組Cap蛋白，并進(jìn)行了免疫原性研究，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、為了解廣東省豬群中豬輸血傳播病毒(TTSuVs)的感染情況，本研究采用Nest-PCR方法對(duì)廣東省7個(gè)不同

3、地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)抽檢采集的159份育肥豬血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，TTSuVs的兩個(gè)種TTSuV1和TTSuV2的陽(yáng)性檢出率分別為54.72％和35.22％，二者的共感染率為29.56％，說(shuō)明TTSuVs在廣東豬群中有較為廣泛的傳播。挑選Nest-PCR檢測(cè)TTSuV1和TTSuV2為陽(yáng)性的樣品，分別在病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增病毒基因，并對(duì)比分析通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的TTSuVs結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF1與NCBI上其它已發(fā)表的不同屬種TTVsO

4、RF1序列的進(jìn)化關(guān)系和同源性。結(jié)果表明豬TTV與人、犬、貓、猴的TTVs處在進(jìn)化樹(shù)的不同分枝，具有很大差異;本次研究獲得的TTSuV1ORF1序列與國(guó)內(nèi)多株已發(fā)表的TTSuV1ORF1序列同源性為72％-75％;獲得的TTSuV2ORF1序列與現(xiàn)有測(cè)序的多株TTSuV2的ORF1序列同源性為88％-97％。
　　2、以本實(shí)驗(yàn)室保存的TTSuV2-GDIMA1為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行ORF1序列的PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序。通過(guò)對(duì)TTSuV

5、2ORF1蛋白的抗原性，信號(hào)肽，跨膜區(qū)，親疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，將TTSuV2ORF1截短成VP1、VP2兩個(gè)片段，分別將這兩片段連入pET-21b載體并通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)蛋白純化，切膠回收獲得高純度的目的蛋白。以獲得的高純度ORF1-VP1與ORF1-VP2蛋白為抗原，以血清樣品中經(jīng)Nest-PCR檢測(cè)TTSuV2呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)。結(jié)果顯示ORF1-VP1與ORF1-VP2的表達(dá)產(chǎn)物均為包

6、涵體。WesternBlot結(jié)果證實(shí)，豬對(duì)TTSuV2的感染的確產(chǎn)生了抗TTSuV2ORF1的IgG抗體，且兩段蛋白均具有抗原性。本研究對(duì)TTSuV2ORF1蛋白的生物信息學(xué)特性進(jìn)行了一定的探索，有利于監(jiān)測(cè)TTSuV2的進(jìn)化情況，為深入研究該病毒的遺傳變異和蛋白質(zhì)功能奠定一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　3、為了分析和篩選TTSuV2ORF1抗原性較好的區(qū)域，本試驗(yàn)將通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的TTSuV2ORF1-VP1和VP2重組蛋白純

7、化后作為間接ELISA檢測(cè)方法的抗原，與Nest-PCR共同檢測(cè)213份豬血清中抗TTSuV2的IgG抗體和病毒DNA。結(jié)果顯示Nest-PCR檢測(cè)呈陰性的部分樣本，通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)呈現(xiàn)出較高抗體水平;而Nest-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的部分血清樣品，其抗體水平卻相對(duì)較低。TTSuV2ORF1-VP1蛋白和VP2蛋白均具有良好反應(yīng)原性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)示其中可能存在中和位點(diǎn)。用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)相同血清中CSFV、PRRSV、PRV、HCV