玉米CMS-S線粒體轉(zhuǎn)錄本orf355-orf77剪切機(jī)制的研究.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility in plant, CMS）是指植株不能夠產(chǎn)生有功能的花粉，但雌蕊發(fā)育正常，能夠受精結(jié)實(shí)的現(xiàn)象，在高等開花植物中普遍存在。植物CMS材料由于其恢復(fù)系來(lái)源廣泛，容易組配雜交種，同時(shí)不育性狀能夠經(jīng)保持系授粉而穩(wěn)定傳遞給下一代，降低去雄成本，提高雜交種純度，而被廣泛用于雜交制種。同時(shí)，玉米CMS也是研究核質(zhì)互作關(guān)系的關(guān)鍵遺傳材料，具有重要的理論研究?jī)r(jià)值。
　　

2、玉米S型雄性不育屬于玉米三種主要不育胞質(zhì)(T、C、S)類型之一，前人研究認(rèn)為其不育性狀是由其線粒體內(nèi)一個(gè)稱為orf355-orf77的嵌合讀碼框造成。orf355-orf77的表達(dá)具有一定的組織特異性，僅在花粉中大量積累，而在葉片和根系中表達(dá)水平非常微弱。在育性恢復(fù)的花粉中，這個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)還出現(xiàn)了較小的RNA片段，因此研究這些小片段RNA的形成機(jī)理進(jìn)將有助于闡明其恢復(fù)機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)以不育系S-Mo17rf3rf3(rf

3、3)和恢復(fù)系S-Mo17Rf3Rf3（Rf3）為材料，對(duì)花粉線粒體orf355-orf77進(jìn)行了初步研究，取得以下主要結(jié)果:
　　 (1)通過3' RACE的方法在1.6kb轉(zhuǎn)錄本中確定了剪切位點(diǎn)，而且該剪切產(chǎn)物在育性恢復(fù)花粉中比在敗育花粉的豐度要高;被剪切之后的片段加上了poly(A)序列，而3'末端帶有poly(A)序列可以加速線粒體內(nèi)RNA分子的降解，因此進(jìn)一步支持orf355-orf77轉(zhuǎn)錄本是在剪切成小片段之后被降解的

4、推論;
　　 (2)通過對(duì)剪切位點(diǎn)的保守性進(jìn)行深入的研究，共鑒定出6個(gè)剪切位點(diǎn)，其中Rf3中3個(gè)剪切位點(diǎn)的附近含有5個(gè)堿基組成的保守序列5'-CCACA-3';
　　 (3)利用含剪切位點(diǎn)的一段約90 nt的堿基進(jìn)行RNA和蛋白的親和層析，分離得到能夠結(jié)合poly(A)的RNA結(jié)合蛋白和一些分子伴侶蛋白;
　　 (4)利用原核表達(dá)載體pGEX-6P-1和pTYB1分別表達(dá)出了orf355的N端（orf355N）和

5、C端（orf355C）的蛋白。并且orf355C在10℃，0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下得到較高濃度的可溶性表達(dá)蛋白;利用原核表達(dá)的蛋白制備相應(yīng)的抗體，Western Blot結(jié)果顯示rf3和Rf3沒有目的條帶出現(xiàn);
　　 在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)玉米CMS-S花粉育性的恢復(fù)機(jī)理進(jìn)行了如下推測(cè):在orf355-orf77的讀碼框內(nèi)發(fā)生了復(fù)雜的剪切過程，導(dǎo)致Rf3中orf355-orf77不育基因的降解，從而使育性

6、恢復(fù)，而rf3中這種剪切降解過程幾乎不存在。Rf3中出現(xiàn)較多的含poly(A)序列的mRNA小片段，這些mRNA小片段在剪切位點(diǎn)的附近含有5'-CCACA-3'的保守序列，該序列是切割蛋白的識(shí)別序列。在剪切過程中還有類似于TCP-1/cpn60的分子伴侶蛋白的參與，并且是高豐度的表達(dá)，而在rf3中該蛋白的濃度非常低。這種分子伴侶蛋白可能在協(xié)助PPR蛋白的過程中發(fā)揮著重要的作用。利用orf355蛋白產(chǎn)物所制備的抗體進(jìn)行Western Bl