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文檔簡介
1、由線粒體遺傳物質(zhì)間重組產(chǎn)生的嵌合基因與很多植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān),位于線粒體呼吸或ATP酶復(fù)合體亞基基因的側(cè)翼區(qū)的嵌合基因往往與之協(xié)同表達(dá),一方面可以通過自身的表達(dá)產(chǎn)物干擾線粒體的正常功能,另一方面還可以通過與這些毗連的功能基因共轉(zhuǎn)錄而影響其mRNA的剪切和翻譯過程,從而使花粉或花器官發(fā)育不正常。在玉米CMS-S中,由重組產(chǎn)生的orf355和orf77位于coxⅠ和coxⅡ的下游,本課題以Mol7rf3rf3為研究材料,CMS-S育性相
2、關(guān)基因orf355、orf77為研究對象,通過結(jié)構(gòu)預(yù)測、原核表達(dá)、洋蔥瞬時表達(dá)來進(jìn)行研究,獲得以下結(jié)果:
1.利用ConPredⅡ和ExPASyProteomicsServer對orf77和orf355的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和疏水性進(jìn)行預(yù)測,可知ORF77有一個跨膜結(jié)構(gòu),ORF355有三個跨膜結(jié)構(gòu),N端都在細(xì)胞膜的外側(cè),具有很強(qiáng)的疏水性。
2.將orf17、orf60、orf77、orf355分別克隆到原核表達(dá)載體
3、pET-28a中,設(shè)置疏水性的atp9為對照,待大腸桿菌生長到對數(shù)中期(OD600=0.5),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測定生長曲線,在SDS-PAGE上檢測不到外源片段的表達(dá),只有含pET-28a-orf355的菌株生長曲線下降,而含其它質(zhì)粒的菌株生長沒有受到影響,說明pET-28a可以表達(dá)疏水性蛋白,orf355的表達(dá)抑制大腸桿菌的生長,不是因ORF355的疏水性而是其潛在的毒性。
3.將orf17、orf60、or77、orf
4、355分別克隆到原核表達(dá)載體pTYB11中,待大腸桿菌生長到對數(shù)中期(OD600=0.5),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測定生長曲線,在SDS-PAGE上檢測不到orf355蛋白的表達(dá),且只有含pTYB11-orf355的菌株生長曲線下降,而含其它質(zhì)粒的菌株生長沒有受到影響,說明orf355的表達(dá)對大腸桿菌的生長有抑制作用,ORF355可能是一種毒性蛋白。
4.在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建pET-28a-EGFP的基礎(chǔ)上,將orf17、orf60
5、、orf77、orf355克隆到EGFP的C端,待大腸桿菌生長到對數(shù)中期(OD600=0.5),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測定生長曲線,在SDS-PAGE上檢測不到orf355的融合蛋白的表達(dá),在熒光顯微鏡下觀察,與對照質(zhì)粒pET-28a-EGFP及未誘導(dǎo)的菌體相比,只有含pET-28a-EGFP-orf355的菌株熒光變?nèi)?,說明orf355的表達(dá)對EGFP的表達(dá)會產(chǎn)生影響,同時生長曲線結(jié)果顯示只有含pET-28a-EGFP-orf355的菌株生
6、長受到抑制,以上結(jié)果表明ORF355可能是一種毒性蛋白。
5.構(gòu)建pET-28a-egfp載體,將orf77、of355克隆到EGFP的N端,待大腸桿菌生長到對數(shù)中期(OD600=0.5),誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測定生長曲線,與對照質(zhì)粒pET-28a及未加誘導(dǎo)劑的陰性對照相比,只有含pET-28a-orf355-egfp的菌株生長受到抑制,而含pET-28a-orf77-egfp的菌株生長沒有受到影響。在熒光顯微鏡下觀察,與對照
7、質(zhì)粒pET-28a-egfp及未誘導(dǎo)的菌體相比,含pET-28a-orf77-egfp的菌株產(chǎn)生微弱的熒光,而含pET-28a-orf355-egfp的菌株沒有熒光,與結(jié)果4-致,說明ORF355可能是一種毒性蛋白。
6.洋蔥瞬時表達(dá)的結(jié)果顯示orf77和orf355能夠在真核細(xì)胞中表達(dá),ORF77出現(xiàn)在洋蔥的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上,ORF355出現(xiàn)在洋蔥的細(xì)胞膜上,這說明了外源蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的部位。
7.總結(jié):線
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