ALS-FTD突變基因C9orf72毒性機制的研究.pdf

1、目的：位于C9orf72基因非編碼區(qū)的六堿基 GGGGCC重復突變可以導致Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）及Frontotemporal dementia（FTD），其致病機制尚不明確。GGGGCC重復可以通過非ATG依賴翻譯多種多聚形式的重復蛋白，但是這些重復蛋白是否具有細胞毒性尚未知曉。本文在不同細胞中研究這些重復蛋白是否具有毒性，并且探索其在ALS和FTD致病機制中的作用。
　　方法：構(gòu)建

2、含有30個GGGGCC重復序列，并且能夠按照不同讀碼框分別表達多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA），多聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP），多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）的N端帶有FLAG標簽的質(zhì)粒。同樣的方法構(gòu)建了GFP標簽位于N端的多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA），多聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP），多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR），多聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）以及多聚脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）的質(zhì)粒。為

3、了排除這些質(zhì)粒中GGGGCC重復RNA毒性的影響，通過合成30個GGAAGA重復序列和30個GGAGCA重復序列，利用密碼子的簡并性，分別構(gòu)建帶有FLAG標簽和GFP標簽的多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）和多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）質(zhì)粒。接著，在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒，通過PI染料免疫熒光觀察，MTT方法檢測這些重復蛋白對細胞的毒性作用。同時為了觀察這些重復蛋白對神經(jīng)細胞的毒性，在NSC-34以及SH-SY5Y細胞

4、中過表達這些質(zhì)粒并用同樣的方法進行檢測。本論文用泛素蛋白酶體抑制劑MG132以及自噬抑制劑Bafilomycin A1處理轉(zhuǎn)染后的細胞，以觀察這些蛋白對泛素蛋白酶體（UPS）和自噬途徑的影響。為探索含精氨酸重復蛋白對核仁功能的影響，利用熒光定量 PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中的核糖體RNA的含量。在HEK293細胞中長時程表達重復蛋白后和核仁應激誘導藥物ActD處理的細胞相對比，以確認核仁應激現(xiàn)象的產(chǎn)生。利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)，分析重復蛋白與哪

5、些蛋白相互作用，同時利用免疫共沉淀的方法進一步確定與哪些蛋白相結(jié)合。利用免疫熒光方法在HEK293細胞中觀察這些重復蛋白對應激顆粒形成的影響。
　　結(jié)果：在所采取的細胞模型中，這五種重復蛋白并不容易產(chǎn)生聚集，而且不受泛素蛋白酶體和自噬調(diào)控。此外，僅僅只有poly-GR和poly-PR定位于核仁，引起關(guān)鍵的核蛋白B23（nucleophosmin）從核仁轉(zhuǎn)運至核質(zhì)，導致核仁應激并引起細胞死亡。這兩種異常翻譯的重復蛋白----poly