副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞的轉錄組學研究與環(huán)介導恒溫擴增法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。副豬嗜血桿菌至少有15個血清型。根據豬健康狀況和菌株毒力的高低，感染后可以造成急性或者慢性的感染。副豬嗜血桿菌感染尤其對早期斷奶的仔豬造成較大的危害。
　　 副豬嗜血桿菌的感染可通過疫苗接種和抗生素治療所控制。但是，對于疾病控制的基礎是能夠準確的診斷出致病病原。采用細菌分離的方法來鑒定副豬嗜血桿菌存在

2、幾個缺陷，一方面是副豬嗜血桿菌對生長條件的要求較高；另一方面是，病豬可能接受過抗生素治療。因此，許多分子診斷方法已被研究和應用。在這些檢測方法中，基于PCR技術的診斷方法能夠快速、靈敏的檢測出副豬嗜血桿菌。但是，在PCR擴增過程中需要用到的具備精密的熱循環(huán)功能的儀器仍然妨礙PCR技術的廣泛應用。環(huán)介導的恒溫擴增法是一種新的恒溫、高效的核酸擴增法。在本研究中，我們以副豬嗜血桿菌高度保守的16S rRNA基因為靶基因，建立了檢測副豬嗜血桿菌

3、的環(huán)介導恒溫擴增法。
　　 天然免疫應答是脊椎動物對抗入侵的外界微生物的第一道防線。天然免疫細胞主要包括中性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等。作為宿主天然免疫細胞的重要一員，巨噬細胞通過直接清除微生物和釋放相應的細胞因子和趨化因子來聚集其它的免疫細胞到感染部位來發(fā)揮其免疫學功能。病原菌要在宿主體內存活和繁殖，必須要突破宿主的免疫屏障。細菌的多樣性造成病原特異的巨噬細胞應答。針對病原菌與宿主相互作用的研究能夠幫助我們理解宿主的防御策

4、略和相應的病原菌的逃避策略。有關副豬嗜血桿菌與豬肺泡巨噬細胞的相互作用的研究已有學者報道。但是未見副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞的免疫應答機制的報道。高通量的cDNA芯片技術為研究宿主與病原菌相互作用提供了一個有力的工具。該技術已經被廣泛的應用到細胞和組織對抗病原感染的差異表達基因的分析中。在本研究中，我們應用高通量的cDNA技術研究豬肺泡巨噬細胞在副豬嗜血桿菌感染后轉錄組的變化來揭示副豬嗜血桿菌感染引起的機體天然免疫應答的機制。

5、>　　 1.副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞的轉錄組學研究
　　 應用昂飛公司的高通量cDNA芯片，在副豬嗜血桿菌感染后6天的豬肺泡巨噬細胞中共鑒定到428個差異表達的基因。通過對這些基因進行注釋、生物進程分析、通路分析、相互作用分析發(fā)現這些基因主要屬于炎性反應、免疫應答、微管聚合、轉錄調節(jié)因子和信號傳導調節(jié)因子。通路分析的結果表明，主要的通路包括：細胞吸附分子(p=3.74E-12)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(p=2.1

6、8E-10)、Toll樣受體信號通路(p=1.93E-05)和MAPK(p=7.63E-04)信號通路等。通過對屬于這些通路的差異表達基因的分析表明機體通過不同的策略激活炎癥反應和免疫應答來對抗副豬嗜血桿菌的感染。特別的，許多差異表達基因與吞噬作用，吞噬溶酶體形成，細胞因子產生和一氧化氮產生等巨噬細胞發(fā)揮生物學功能的生物進程相關。這些差異基因能夠幫助我們更好的理解巨噬細胞發(fā)揮其生物學功能的復雜的機制。進一步，全部428個基因編碼的蛋白的

7、相互作用網絡和六個重要的子互作網絡用STRING和IPA預測。通過對差異表達基因編碼的蛋白的互作分析表明，大多數差異表達基因編碼的蛋白存在相互作用。但是有些差異表達基因編碼的蛋白之間可能并不存在相互作用或相互作用還沒有被發(fā)現。在差異表達基因中，我們發(fā)現coronin la，s100a4和s100a6三個基因在許多生物進程及通路中發(fā)揮著重要的作用，提示這三個基因可能是新的副豬嗜血桿菌感染相關基因。為了研究這三個基因，我們克隆并測序了豬的c

8、oronin1a，s100a4和s100a6基因。序列上傳NCBI：coronin1a ID：[GenBank：JN092377]；s100a4 ID：[GenBank：JN122624.1]；s100a6ID：[GenBank：DQ372082.1]，這三個基因均為首次在豬中報道。對這三個基因進化樹分析表明，豬的CORONIN1A與牛的CORONIN1A聚到一個分支上；豬的S100A6與馬的S100A6聚到一個分支上；豬的S100A4

9、與人、獼猴、黑猩猩和毛猩猩的同源性較高。對這三個基因的結構預測表明，豬的CORONIN1A在N端具有可能的Trp-Asp(WD)repeats signature，Trp-Asp(WD)repeats profile and Trp-Asp(WD)repeats circular profile等功能結構域；豬的S100A4和S100A6具有可能的S-100calcium binding protein signature，EF-han

10、d calcium-binding domain profile等功能結構域。我們進一步研究了這三個基因的組織分布。結果表明豬coronin1a，s100a4和s100a6分別在胰腺，小腦，胰腺中的表達量最高。我們進一步挑選S100A4和S100A6進行免疫刺激實驗。實驗結果表明，s100a4和s100a6在PK-15細胞內能夠被LPS和Poly(I：C)在48小時內誘導上調表達。另外，我們還比較了S100A4和S100A6在感染副豬嗜

11、血桿菌與正常豬的組織中的表達情況。qPCR和免疫組化結果表明S100A4和S100A6在副豬嗜血桿菌感染的豬的肺臟、脾臟和淋巴結中上調表達。證明S100A4和S100A6是兩個新鑒定到的副豬嗜血桿菌感染相關基因。
　　 2.LAMP法檢測副豬嗜血桿菌
　　 以副豬嗜血桿菌16S rRNA基因為靶基因，建立了檢測副豬嗜血桿菌的環(huán)介導恒溫擴增法。反應在61℃溫度下進行，60分鐘內能完成LAMP擴增。結果可以通過電泳和染色進行

12、觀察。通過對31株副豬嗜血桿菌和28株其它種屬的細菌的檢測表明，LAMP具有高度特異性，并且具有比nested PCR更高的檢測靈敏度。我們進一步應用LAMP、nested PCR和細菌分離對臨床樣品和人工感染樣品進行檢測。LAMP、nested PCR和細菌分離分別用于針對55份健康豬肺臟的檢測中。結果顯示，應用這三種檢測方法均不能在55份健康豬的肺臟中檢測到副豬嗜血桿菌。LAMP、nested PCR和細菌分離三種方法用于針對122