副豬嗜血桿菌基因組學及毒力相關(guān)因子研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定殖在豬上呼吸道中的常在菌群組成之一,同時也是引起豬Glasser氏病的病原體,該病在臨床上以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。
　　 目前,世界各主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)都有關(guān)于該病流行和暴發(fā)的報道。隨著養(yǎng)殖管理方式的轉(zhuǎn)變,這些包括早期斷奶技術(shù)的廣泛推廣使用和建立無特定病原體豬群等,使HPS成為影響當前養(yǎng)豬業(yè)最重要的細菌性病原的因為之一。由于獸醫(yī)臨床上表型差異菌

2、株廣泛存在,尤其是對不同毒力表型菌株差異的本質(zhì)認識不足,關(guān)于HPS毒力相關(guān)因子,HPS感染宿主過程中如何發(fā)揮致病作用以及病原宿主相互作用的分子基礎(chǔ)等知之甚少。因此,迫切需要破譯副豬嗜血桿菌的全套遺傳物質(zhì),為進行副豬嗜血桿菌功能基因研究開辟道路。以本實驗室分離鑒定的副豬嗜血桿菌為主要研究材料,以我國流行的優(yōu)勢血清5型菌株SH0165為親本株,通過對其完成全基因組測序,系統(tǒng)分析了副豬嗜血桿菌的毒力相關(guān)基因組成、體內(nèi)感染過程中應激基因變化規(guī)律

3、以及可能毒力表型遺傳演化規(guī)律。具體工作如下:
　　 1.副豬嗜血桿菌基因分型及基因組測序菌株篩選
　　 為了篩選副豬嗜血桿菌測序菌株,從我國不同地區(qū)分離鑒定的副豬嗜血桿菌菌株中選取具有代表性的17株,與17株國際標準血清型參考菌株進行遺傳進化分析,利用18個保守基因的串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)生樹,結(jié)果表明副豬嗜血桿菌菌群至少可以分為2個基因型,我國的流行菌株大多屬于基因A型中,同時分析鑒定了兩個潛在區(qū)分強弱毒力菌株的分子靶

4、標-ompP2和sodA基因。從基因A型中挑選生物學背景清楚的我國流行血清5型SH0165菌株作為副豬嗜血桿菌全基因組測序的強毒株。
　　 2.副豬嗜血桿菌SH0165菌株的全基因組測序分析
　　 通過“鳥槍法”測序策略,利用20,102條測序reads先后三輪拼接完成第一株副豬嗜血桿菌全基因組,之后通過酶切和long PCR方法確證SH0165基因組框架的正確性。全基因組分析結(jié)果表明SH0165基因組由2,269,15

5、6個核苷酸組成一個環(huán)狀染色體,G+C％含量為39.99％,編碼2299個基因。在SH0165基因組進行基因注釋的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)的對基因的功能分類、編碼蛋白特征、代謝途徑中基因組成、噬菌體相關(guān)基因、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、假基因以及信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控相關(guān)基因進行分析總結(jié)。
　　 3.副豬嗜血桿菌SH0165菌株潛在毒力因子分析
　　 利用8株已完成嗜血桿菌屬全基因組序列,通過比較不同菌種菌株的毒力因子進行同源分析,同時參考Pubmed數(shù)據(jù)

6、庫中嗜血桿菌屬毒力基因的研究文獻,第一次系統(tǒng)總結(jié)副豬嗜血桿菌不同功能分類的毒力相關(guān)基因。通過SH0165基因組預測的全套毒力相關(guān)基因在體內(nèi)感染以及體外模擬感染條件下差異表達基因規(guī)律的分析,總結(jié)出18個主要的毒力相關(guān)基因或操縱子基因,并通過PCR篩查分析發(fā)現(xiàn),以上18個毒力相關(guān)基因或操縱子基因在我國流行菌株中高度保守,推測這些毒力因子可能是毒力菌株發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵因子。
　　 4.副豬嗜血桿菌SH0165體內(nèi)感染應激基因分析

7、r>　　 利用新一代測序技術(shù)--Illumina Solexa,對體內(nèi)感染條件下(腦組織和肺組織中)副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦組織中特異性的有2個的噬菌體島的相關(guān)基因表達顯著上調(diào),并推測噬菌體攜帶的基因可能是副豬嗜血桿菌參與腦組織感染的效應因子。兩種情況下共同誘導上調(diào)表達的基因一共305個,這些基因主要參與核苷酸生物合成、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化途徑以及抗氧化相關(guān),推測感染過程中副豬嗜血桿菌通過提高自身合成與能量代謝效率實現(xiàn)增殖,同時

8、通過操控自身抗氧化基因的上調(diào)表達逃逸宿主氧化危機。提示核苷酸生物合成以及能量合成與轉(zhuǎn)化途徑中的關(guān)鍵酶類具有開發(fā)成為抗副豬嗜血桿菌感染靶標的潛力。
　　 5.副豬嗜血桿菌毒力表型進化規(guī)律分析
　　 利用已知的20株巴氏桿菌科基因組序列,通過16S rDNA和35個保守基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹以及基因組同源基因作圖分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴斯德菌科菌種存在兩個進化分支,副豬嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌遺傳進化上最接近,而與嗜血桿菌屬其他成員親

9、緣關(guān)系較遠,證實副豬嗜血桿菌分類上獨立于嗜血桿菌屬之外形成一個相對獨特的進化分支。
　　 通過比較該科成員中致病菌株與非致病菌株基因組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌科成員存在的基因組減少進化規(guī)律,比較29755與SH0165基因組發(fā)現(xiàn),兩株副豬嗜血桿菌的差異主要在噬菌體基因組成和數(shù)量上。結(jié)合SH0165基因組特點,推測噬菌體介導的外源毒力相關(guān)基因的水平轉(zhuǎn)移和宿主菌功能基因的丟失(形成較多假基因)導致SH0165菌株經(jīng)歷一個基因組快速變化階段,而