ARC蛋白對胰島素誘發(fā)的肉雞心肌細胞肥大c-myc基因表達的影響.pdf

1、在禽類疾病中，腹水綜合癥是一種嚴重的代謝性疾病，具有很高的致病率和致死率，這使得在世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)（禽類）的生產(chǎn)成本大大提高了。肉雞腹水綜合癥的一個突出的病理學(xué)特征是右心室的肥大，引起心室肥大的原因主要是心肌細胞自身的肥大而不是心肌細胞數(shù)量的增多。ARC蛋白在心臟和腦等組織中高度的表達，最早被認為是抑制caspase-2和caspase-8的活性而發(fā)揮其功能。它具有保護線粒體的功能，可以很好的抑制細胞的凋亡和肥大。原癌基因c-myc在細

2、胞的生長控制、肥大和凋亡過程中有舉足輕重的作用，它在幾乎所有的正常細胞的增殖過程中都有表達，并嚴格依賴于有絲分裂的刺激。有研究證實，c-myc在一些正常發(fā)生的腫瘤細胞中也有異常的表達。c-myc基因可能是直接導(dǎo)致心肌肥大的因子，因為它是很多類型細胞增長的關(guān)鍵性物質(zhì)，只要有它的參與，幾乎所有的刺激作用都會引起心肌的（不管是在培養(yǎng)的細胞或者是完整的心肌）肥厚。因此，c-myc基因可能是一個直接進行調(diào)解心肌肥大的因子。綜上所述，本實驗的目的是

3、研究ARC蛋白對胰島素誘導(dǎo)的肉雞雞胚心肌細胞肥大過程中c-myc基因的影響，進一步探討ARC蛋白抑制心肌細胞肥大的機理是否與其抑制原癌基因c-myc的表達有關(guān)。
　　 本次實驗采用9-11日齡的雞胚，無菌條件下取出心臟組織，去除心包膜及動靜脈血管，用膠原酶消化的方法體外培養(yǎng)心肌細胞。為制造心肌肥大細胞模型，本實驗采用胰島素誘導(dǎo)的辦法，每組添加不同濃度的胰島素，48h后測量其直徑和表面積，經(jīng)數(shù)據(jù)分析軟件分析后，取表面積和直徑最大，

4、細胞活性最好的組來做后續(xù)的實驗組。由于肉雞體內(nèi)沒有ARC蛋白，因此本實驗構(gòu)建了重組PEGFP-N1/ARC質(zhì)粒并將它轉(zhuǎn)染到肉雞雞胚的心肌細胞中使其表達，觀察外源ARC對心肌細胞肥大的影響。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，運用熒光定量PCR反應(yīng)檢測心肌細胞中c-myc基因的mRNA的表達量，從而觀察ARC蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上對c-myc基因的影響;用Elisa方法檢測心肌細胞c-myc基因的蛋白表達量，從而觀察ARC蛋白在翻譯水平上對c-myc基因的影響。<

5、br>　　 實驗結(jié)果如下:心肌細胞培養(yǎng)48h后，用不同濃度胰島素刺激它，結(jié)果顯示當(dāng)濃度為10-7mol/L時，心肌細胞的直徑和表面積最大，細胞活性最好，其直徑(17.66±1.346)μm，與對照組(15.57±1.803)μm相比，有顯著性升高(P＜0.05)，其表面積(283.8±62.8)μm2，與對照組(231.0±148.3)μm2相比，也有顯著性升高(P＜0.05)，因此本實驗采用胰島素的濃度為10-7mol/L作為刺激細

6、胞肥大濃度。加入胰島素后，c-myc基因的mRNA和蛋白的表達量有所增強(P＜0.05);在細胞中轉(zhuǎn)染ARC蛋白后，c-myc基因的mRNA和蛋白的表達量較沒轉(zhuǎn)染的組相比有所下降(P＜0.05)，而單獨轉(zhuǎn)染ARC蛋白對c-myc基因的mRNA和蛋白的表達量影響不大。實驗結(jié)果顯示:當(dāng)胰島素的濃度為10-7mol/L時，肉雞心肌細胞的肥大效果最好;用同樣濃度胰島素刺激心肌細胞后，轉(zhuǎn)染了ARC蛋白的組與未轉(zhuǎn)染的組相比，c-myc基因的表達明顯

7、降低。由此推測，ARC蛋白可能通過抑制c-myc基因的表達量從而抑制了心肌細胞的肥大。
　　 鈣離子作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，在胰島素誘導(dǎo)心肌肥大和原癌基因c-myc表達量升高的過程中起至關(guān)重要的作用。ARC蛋白可以通過其C末端與鈣離子相結(jié)合，阻止由ATP刺激而引起的鈣離子濃度的持續(xù)升高，低濃度的鈣離子抑制了原癌基因c-myc的表達，從而一定程度的抑制了心肌細胞的凋亡和肥大。由此推斷，ARC蛋白抑制細胞肥大過程可能與其抑制了c-m