Tat-Cry1Ac結(jié)構(gòu)域基因表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，其殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，簡稱ICPs)是轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中最成功的殺蟲活性蛋白。ICPs的結(jié)構(gòu)域在昆蟲的毒殺過程中起著重要的作用，然而對(duì)于ICPs各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能及其與殺蟲活性的關(guān)系的問題，一直是學(xué)術(shù)界爭論的熱點(diǎn)。如何從分子生物學(xué)角度充分的解釋各結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系問題不論對(duì)基因的

2、改造還是遺傳重組都將起到不可估量的作用。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein Transduction Domain，PTD)是一類能自動(dòng)穿透細(xì)胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)的一段富含精氨酸的多肽，目前在醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。 為驗(yàn)證殺蟲晶體蛋白各結(jié)構(gòu)域的作用，及Tat對(duì)各結(jié)構(gòu)域的影響。本實(shí)驗(yàn)利用PCR的方法，合成9對(duì)引物擴(kuò)增出各結(jié)構(gòu)域及組合和包含Tat肽的各結(jié)構(gòu)域及組合的共12個(gè)片段經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建的陽性克隆子

3、。經(jīng)PCR、質(zhì)粒單雙酶切、測序證明已成功構(gòu)建出了pET1AcⅠ、pET1AcⅠ—Ⅱ、pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pET1AcⅡ、pET1AcⅡ—Ⅲ、pET1AcⅢ、pETT1AcⅠ、pETT1AcⅠ—Ⅱ、pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pETT1AcⅡ、pETT1AcⅡ—Ⅲ、pETT1AcⅢ等12個(gè)融合表達(dá)載體。 構(gòu)建的融合蛋白通過對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證得到：當(dāng)IPTG濃度為

4、0.1mM、15℃誘導(dǎo)24h表達(dá)的蛋白含量最高。 在優(yōu)化的表達(dá)條件下12個(gè)融合蛋白：pET1AcⅠ、pET1AcⅠ—Ⅱ、pET1AcⅡ、pETT1AcⅠ—Ⅱ、pETT1AcⅡ—Ⅲ以可溶的形式存在。pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pET1AcⅡ—Ⅲ、pET1AcⅢ、pETT1AcⅠ、pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ、pETT1AcⅡ、pETT1AcⅢ以包涵體的形式存在。 以pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ為代表進(jìn)行蛋白純化條件的摸索，結(jié)果得出當(dāng)咪

5、唑濃度為40mM時(shí)可將靶標(biāo)蛋白完全洗脫出來，并在此條件下純化出pET1AcⅠ蛋白。 對(duì)表達(dá)的粗蛋白進(jìn)行生物活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)π〔硕昃袣⑾x活性但活性普遍較低只有全長的pETT1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ較全長的pET1AcⅠ—Ⅱ—Ⅲ有較高的殺蟲活性，且殺蟲活性達(dá)到了92.31％；含Tat的6個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白較不含Tat的6個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白殺蟲活性增強(qiáng)，但總體殺蟲活性增加不顯著。各個(gè)結(jié)構(gòu)域組合后殺蟲活性并未呈現(xiàn)疊加效應(yīng)，相反殺蟲活性明顯降