基于核酸適配體的細菌內(nèi)毒素液相和固-液相檢測方法研究.pdf

1、感染性疾病是世界十大致命性疾病之一,尤其是在發(fā)展中國家,兒童和外傷患者因感染性疾病導致的死亡率較高。在感染性疾病中,以革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染敗血癥、內(nèi)毒素血癥及其休克的臨床死亡率最高。GNB感染時,細菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即內(nèi)毒素(Endotoxin)進入血循環(huán),激活多種炎癥細胞釋放炎性介質(zhì),引起炎癥反應,嚴重時可導致多器官功能衰竭。
　　

2、 LPS是GNB外膜的主要成分,由類脂A、核心寡聚糖和O-特異性多糖側鏈三部分組成。LPS對于維持GNB的外膜滲透性和流動性及其致病過程起主要作用。LPS還可直接或間接誘導免疫細胞凋亡,抑制機體免疫功能,從而加重敗血癥的發(fā)生,因此LPS的檢測具有重要的醫(yī)學意義。目前臨床上內(nèi)毒素的檢測方法,主要有鱟變形細胞溶解物(LAL)試驗、動態(tài)濁度法、與重組因子C相關的檢測方法等,但主要還是以鱟變形細胞溶解物試驗最為常用,該方法靈敏度和特異性較高,但

3、對LPS的污染極為敏感,對所用器皿的消毒要求高,且活性易受某些金屬離子、抗生素、氨基酸、糖類、血漿蛋白等影響,檢測品種有限。
　　 近年的研究表明,DNA和RNA不僅僅起遺傳信息儲存和傳遞的作用,而且可以通過自身特有的結構與其它類型分子相互作用,以此為基礎可以建立人工設計的隨機寡核苷酸庫,從這類隨機序列庫中篩選出與靶分子高度特異結合片段的過程,稱為指數(shù)富集系統(tǒng)進化配體(systematic evolution of ligand

4、s byexponential enrichment,SELEX),篩選出的分子被稱為“核酸適配體”(適體,aptamer),其作用形式與抗體相似,可與靶分子高親和力、特異性的結合,其解離常數(shù)可達到pg級。
　　 本課題擬采用核酸適配體技術研究出一種靈敏度高、特異性高、穩(wěn)定性強、且不易受外界因素影響的新型細菌內(nèi)毒素檢測方法,同時也可為相關的內(nèi)毒素檢測試劑盒或生物傳感器的研發(fā)提供基礎,既能滿足對細菌內(nèi)毒素檢測快速準確的要求,又能降

5、低檢測成本,擴大應用范圍,為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P的領域中的內(nèi)毒素檢測開創(chuàng)新的途徑。
　　 方法:1緩沖溶液的選擇。選取新鮮滅菌注射用水(WFI,pH=5.61,內(nèi)毒素含量<0.03 EU/ml)、磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1mol/L,pH=7.3,用滅菌純凈水配制)和三羥甲基氨基甲烷(Tris,0.02mol/L,pH=7.4)參與培育內(nèi)毒素與核酸適配體的介質(zhì)環(huán)境選擇性實驗。2 培育時間的優(yōu)化。

6、選擇PBS作為培育介質(zhì)進行最佳培育時間的選擇試驗,根據(jù)相關參考文獻和多次的預試驗結果,具體的時間分組為30 min、1 h、2 h、2 h、4 h。3 核酸適配體最佳摩爾量的優(yōu)化。分別選取5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 劑量組的核酸適配體進行最佳摩爾量的優(yōu)化實驗。4 內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較。核酸適配體的選擇性是衡量該方法優(yōu)劣的重要因素之一。隨機選取一段核酸適配體,即Aptamer

7、Ⅲ分別取代Aptamer Ⅰ和Aptamer Ⅱ與LPS反應,以確定LPS與其他Aptamer是否有非特異性結合。5 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測。綜合以上各種檢測條件的優(yōu)化結果,并將內(nèi)毒素分為0.0312 EU/ml、0.0625 EU/ml組、0.125 EU/ml組、0.25 EU/ml組、0.5 EU/ml組、1 EU/ml組、2 EU/ml組、4 EU/ml組,進行內(nèi)毒素核酸適配體的固-液相檢測。6 基于核酸適配體用

8、于內(nèi)毒素的檢測(液相檢測)。將羥基活化的磁性納米顆粒與一條5ˊ端帶氨基修飾的適體(Aptamer,核酸適配體)反應結合,利用適體與LPS的強結合作用捕獲LPS分子,并通過磁性分離技術去除雜質(zhì)蛋白干擾。另一條帶熒光標記的適體結合LPS的另一位點,用以測定LPS的量。7 凝膠法檢測磁珠分離液。將吸附在磁珠上的細菌內(nèi)毒素和核酸適配體結合物用特定的方法洗脫下來,并用鱟試劑對洗脫液進行檢測,以證實內(nèi)毒素液相檢測的有效性。8 固-液相和液相檢測反應

9、液穩(wěn)定性檢測。將固-液相和液相檢測反應液分別置于37℃恒溫箱內(nèi)放置6 h、12 h、24 h,再用熒光分光光度計測其熒光值。9統(tǒng)計學分析。均采用SPSS13.0版本進行統(tǒng)計學分析,基于核酸適配體的內(nèi)毒素液相和固相-液相檢測用雙變量相關分析(Pearson's)進行分析；單變量方差分析和析因設計的方差分析用于緩沖溶液的選擇、培育時間的優(yōu)化、核酸適配體劑量的優(yōu)化、內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較實驗,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示

10、,另外,用兩兩比較LSD分析方法進行各實驗組之間的統(tǒng)計學驗證。
　　 結果:1 緩沖溶液的選擇。內(nèi)毒素在新鮮滅菌注射用水(WFI)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液與核酸適配體共同孵育,都可產(chǎn)生相互的親和作用(F=2227.874,P=0.000)。內(nèi)毒素在三種緩沖液中的熒光信號差異無統(tǒng)計學意義(F=0.119,P=0.889)。磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖液中所含的Mg2+、ca2+、Na+和K+等離子的濃度對內(nèi)毒

11、素與其核酸適配體的結合沒有影響。選擇這三種緩沖液中的其中一種作為內(nèi)毒素與核酸適配體孵育的介質(zhì)環(huán)境均可行。2培育時間的優(yōu)化。在孵育初期,隨著時間的逐漸增加,熒光強度慢慢增強,內(nèi)毒素結合核酸適配體的量逐漸增加,孵育2 h后熒光強度趨于穩(wěn)定,在該濃度下,熒光強度基本達到飽和狀態(tài),此時內(nèi)毒素與核酸適配的結合作用基本完成,在各時間段里內(nèi)毒素均可與核酸適配體產(chǎn)生結合作用(F=922.448,P=0.000)。另外,對于2 h和4 h所測得的結果,兩

12、者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.850),在此選擇2 h作為核酸適配體與內(nèi)毒素的培育時間。3 核酸適配體最佳摩爾量的的優(yōu)化。內(nèi)毒素與不同濃度的核酸適配體Ⅰ結合后再與固定濃度的核酸適配體Ⅱ反應,各個濃度劑量組均與內(nèi)毒素產(chǎn)生結合反應(F=17323.631,P=0.000)。從最小濃度的5μmol/L,開始熒光強度逐漸增強,尤其是5μmol/L到10 μmol/L之間的坡度最明顯,析因設計資料的兩兩比較統(tǒng)計學分析表明,兩劑量組之間的差異具有統(tǒng)計

13、學意義(P<0.001),10 μmol/L到80μmol/L的熒光數(shù)值漸趨穩(wěn)定,
　　 經(jīng)多重比較統(tǒng)計學分析,不同濃度之間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.5),在此選擇10 μmol/L的核酸適配體Ⅰ作為孵育濃度。內(nèi)毒素和固定濃度的核酸適配體Ⅰ結合后與不同濃度的核酸適配體Ⅱ孵育過程中,各個劑量組均與內(nèi)毒素產(chǎn)生結合反應(F=22658.582,P=0.000)。從最小濃度的5 μmol/L開始熒光強度逐漸增強,尤其是5 μmol/

14、L到10μmol/L之間的坡度最明顯,析因設計資料的兩兩比較統(tǒng)計學分析表明,兩劑量組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001),10μmol/L到80μmol/L的熒光數(shù)值漸趨穩(wěn)定,經(jīng)統(tǒng)計學分析,它們之間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.5),因此,選擇10μmol/L的核酸適配體Ⅱ作為孵育濃度。4 內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較。當以任意DNA系列代替檢測中的一條核酸適配體時,都不能形成三明治結構,在溶液中檢測不到明顯的熒光,經(jīng)過各序列

15、組間析因設計資料的方差分析兩兩比較統(tǒng)計學比較驗證,B和C曲線之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.909)。僅當溶液中存在與內(nèi)毒素兩個作用位點特異性結合的兩條核酸適配體時才能形成三明治結構,A和B、c曲線之間差異有顯著性意義(P=0.000)。5 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測。熒光強度隨內(nèi)毒素劑量升高而升高,兩者呈線性關系,經(jīng)雙變量相關分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素和熒光強度兩者呈顯著相關關系(Pearson's:r=0.897,P=0.003)。經(jīng)

16、過檢測條件的優(yōu)化后,可以看到溶液中的熒光強度隨著內(nèi)毒素的劑量升高而升高,提示著運用核酸適配體與靶標內(nèi)毒素的強親和力來檢測內(nèi)毒素取得了較好的效果。6基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的檢測(液相檢測)。熒光強度隨著內(nèi)毒素劑量的升高而升高,兩者呈線性關系,熒光強度呈明顯的LPS濃度依賴性增高,經(jīng)雙變量相關分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素和熒光強度兩者呈顯著相關關系(Pearson’s:r=0.867,P=0.005)。7 凝膠法檢測磁珠分離液。除了0.0312 EU/

17、ml組因劑量較小的緣故未見明顯陽性反應之外,其余各組均出現(xiàn)不同程度的凝膠現(xiàn)象。由此判斷,把結合到磁珠上的物質(zhì)用特定的方法洗脫下來,并通過凝膠法證實磁珠分離液中含有內(nèi)毒素成份,也可間接反證上述的磁珠/核酸適配體/內(nèi)毒素結合實驗是有效的。8 固-液相和液相檢測反應液穩(wěn)定性檢測。在各時間段,即6 h組、12h組、24 h組熒光信號均未見明顯衰減,固-液相和液相兩種檢測方法檢測細菌內(nèi)毒素具有很強的穩(wěn)定性,檢測結果不隨時間的增長而產(chǎn)生明顯變化。<

18、br>　　 結論:
　　 1 采用2個不同適體與內(nèi)毒素形成高親和力的三明治結構用于檢測內(nèi)毒素方法可行,其檢測線性范圍寬,特異性強,靈敏度高,檢測信號穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,且不以內(nèi)毒素為靶標的無關適體對其沒有干擾。
　　 2 液相檢測法中采用磁珠分離技術可大大消除非特異性吸附,進一步提高檢測效率,敏感度比固-液相檢測法要高。
　　 3 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測和液相檢測的檢測結果具有很強的穩(wěn)定性,在24h