漢坦病毒雙啟動(dòng)子雙基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫活性的檢測(cè).pdf

1、漢坦病毒(hantaan virus,HV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus),是腎綜合征出血熱(hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS)的病原體。HFRS是嚴(yán)重危害人體健康的急性病毒性傳染病,臨床上尚無(wú)特異性治療藥物,疫苗的研制及應(yīng)用是預(yù)防和控制其流行的重要措施。HV病毒的核酸為單股負(fù)鏈RNA,基因組由L、M、S三個(gè)片段組成,分別編碼病毒的聚合酶、

2、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣殼蛋白(NP)。M片段編碼的G1、G2包膜糖蛋白含有病毒的毒力位點(diǎn)、中和性抗原及型特異性抗原位點(diǎn)等多種抗原決定簇,因此M片段是一個(gè)很好的疫苗候選抗原[1]。根據(jù)血清學(xué)檢查,引起HFRS的病原體主要是漢坦病毒的兩個(gè)亞型即漢灘病毒(HTNV)和漢城病毒(SEOV),但是近年來(lái)出現(xiàn)了很多病毒變異株。傳統(tǒng)疫苗制作過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng),其保護(hù)作用比較單一、造價(jià)高,且有病毒毒力“返祖”現(xiàn)象,多抗原組分可誘發(fā)自身免疫性疾病等

3、缺點(diǎn),所以需要研制一種新型高效疫苗。核酸疫苗具有制作過(guò)程簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)可靠、不接觸病原體、可以精選所需要的基因片段、不表達(dá)無(wú)關(guān)抗原等優(yōu)點(diǎn),給Hv疫苗的研制提供了新的思路。
　　 針對(duì)目前一般核酸疫苗免疫原性較低及HV混合感染的現(xiàn)象,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用兩個(gè)啟動(dòng)子、以HTNV和SEOV的M2基因片段為抗原基因,利用反向疫苗學(xué)技術(shù),構(gòu)建兩個(gè)啟動(dòng)子頭尾相接的順式和頭頭相接的反式雙價(jià)真核表達(dá)載體,觀(guān)察兩個(gè)載體能否在真核細(xì)胞中表達(dá)及其對(duì)動(dòng)物的免疫

4、效果。同時(shí)探討兩個(gè)啟動(dòng)子及啟動(dòng)子的排列方式對(duì)其免疫活性是否有影響,以期構(gòu)建出一種多基因高效疫苗,為HV疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、構(gòu)建pETBlue2-CM1重組表達(dá)載體：
　　 (一)真核表達(dá)元件的獲取
　　 參照載體構(gòu)建方法,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增真核表達(dá)元件即CMV啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)及polyA部分,將此真核表達(dá)元件命名為CM1。利用PCR在CM1的兩端添加合適的酶切位點(diǎn),根據(jù)添加酶切位

5、點(diǎn)的順序不同,將片段分為正向和反向,稱(chēng)為正向CM1和反向CM1。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后回收,-20℃保存。
　　 (二)pETBlue2-CM1載體的構(gòu)建
　　 將得到的正向CM1和反向CM1分別插入pETBlue2載體中,構(gòu)建pETBlue2-正向CMI和pETBlue2-反向CMI重組載體。酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。
　　 二、兩型M2基因片段的獲?。?br>　　 應(yīng)用反向疫苗學(xué)技術(shù),對(duì)兩性M2基因片段

6、的抗原決定簇、跨膜蛋白等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,確定PCR擴(kuò)增的片段。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,擴(kuò)增HTNV76118M2和SEOVSeoulBjHD01M2片段(簡(jiǎn)稱(chēng)SEOM2),并利用PCR在基因的兩端添加CpG序列和合適的酶切位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳回收后-20℃保存。
　　 三、構(gòu)建pETBlue2-正向/反向CM1-76118M2載體：
　　 按載體構(gòu)建的常規(guī)方法,將76118M2片段分別插入pETBlue2-正向CM1和pETBlue

7、2-反向CM1重組表達(dá)載體中,構(gòu)建pETBlue2-正向CM1-76118M2和pETBlue2-反向CM1-76118M2載體。酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。
　　 四、單質(zhì)粒單啟動(dòng)子載體的構(gòu)建：
　　 (一)pcDNA3.1+76118M2載體的構(gòu)建
　　 將76118M2片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+中,構(gòu)建pcDNA3.1+76118M2載體。酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。
　　 (二)pcDNA3.

8、1+SEOM2載體的構(gòu)建：、
　　 將SEOM2片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+中,構(gòu)建pcDNA3.1+SEOM2載體。酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。
　　 五、單質(zhì)粒順式和反式雙啟動(dòng)子雙基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建：
　　 將pETBlue2-正向CM1-76118M2和pETBlue2-反向CM1-76118M2載體中含真核表達(dá)元件和目的基因的部分分別插入pcDNA3.1+SEOM2中,構(gòu)建單質(zhì)粒順式pcDNA3

9、.1+SEOM2-CM1-76118M2和反式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2真核表達(dá)載體。
　　 六、雙啟動(dòng)子雙基因載體在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)：
　　 將構(gòu)建的單質(zhì)粒順式和反式雙啟動(dòng)子雙基因載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞Vero-6,培養(yǎng)48小時(shí)后用間接免疫熒光檢測(cè)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 七、雙啟動(dòng)子雙基因載體在動(dòng)物體內(nèi)免疫活性的檢測(cè)：
　　 (一)動(dòng)物免疫
　　 取90只小鼠,

10、隨機(jī)分為6組,分別注射pcDNA3.1+、pcDNA3.1+76118M2、pcDNA3.1+SEOM2、pcDNA3.1+76118M2與pcDNA3.1+SEOM2聯(lián)合、順式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2和反式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2質(zhì)粒,質(zhì)粒通過(guò)肌肉注射,兩周以后加強(qiáng)免疫一次,共免疫三次。
　　 (二)血清特異性抗體及細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　 初次免疫后1d、7d、17

11、d、31d、60d、90d后收集各免疫組小鼠的血清及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用ELISA法檢測(cè)各組血清中特異性IgG抗體、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4及IL-10水平。用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖水平,從而判斷質(zhì)粒對(duì)動(dòng)物的免疫效果。
　　 結(jié)果：
　　 一、pETBlue2重組片段載體的鑒定
　　 (一)真核表達(dá)元件的獲取
　　 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,獲得大小約為1000bp的條帶,與

12、預(yù)期結(jié)果一致。
　　 (二)pETBlue2重組片段載體的鑒定
　　 用Xhol單酶切pETBlue2-正向CM1和pETBlue2-反向CM1重組片段載體,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,前者得到兩個(gè)大小約為4200bp和350bp的條帶,后者獲得兩個(gè)大小約為3700bp和850bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致.經(jīng)序列分析,所得的結(jié)果與Geneballk中相應(yīng)的核苷酸序列比對(duì),同源性達(dá)100％。
　　 二、雙型M2基因片

13、段的獲取
　　 PCR擴(kuò)增的76118M2產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得大小約1300bp條帶,擴(kuò)增SEOM2獲得大小約10001bp)條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 三、pETBlue2-正/反向CM1-76118M2載體的鑒定所得的正向和反向載體經(jīng)Xhol單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,前者獲得兩個(gè)大小約為5500bp和350bp的條帶,后者獲得兩個(gè)大小約為3700bp和2100bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)序列分析,所得的結(jié)果與

14、Genebank中相應(yīng)的核苷酸序列比對(duì),同源性達(dá)100％。
　　 四、單質(zhì)粒單啟動(dòng)子載體的鑒定
　　 (一)pcDNA3.1+76118M2載體的鑒定
　　 所得的載體經(jīng)Pst I單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,獲得大小約為5200bp和1000bp的兩個(gè)條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)序列分析,所得的結(jié)果與Genelbank中相應(yīng)的核苷酸序列比對(duì),同源性達(dá)100％。
　　 (二)pcDNA3.1+SEOM2載體的鑒定<

15、br>　　 所得的載體經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切鑒定后瓊脂糖凝膠電泳,獲得兩條大小約為4200bp和1900bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)系列分析,所得的結(jié)果與GenebDank中相應(yīng)的核苷酸序列比對(duì),同源性達(dá)100％。
　　 五、順式和反式雙啟動(dòng)子雙基因載體的酶切鑒定
　　 單質(zhì)粒順式和反式雙啟動(dòng)子雙基因載體經(jīng)XhoI單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,前者獲得兩個(gè)大小約為6500bp和1800bp的條帶,后者獲得兩個(gè)大小

16、約為4700bp和3600bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 六、雙啟動(dòng)子雙基因真核表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
　　 將構(gòu)建的兩種載體轉(zhuǎn)染Vero-6細(xì)胞后,均可在細(xì)胞漿中觀(guān)察到綠色熒光,說(shuō)明兩個(gè)重組質(zhì)粒都能在真核細(xì)胞Vero-6中正常表達(dá)。
　　 七、雙啟動(dòng)子雙基因真核表達(dá)載體在動(dòng)物體內(nèi)的免疫活性檢測(cè)
　　 ELISA結(jié)果顯示,雙啟動(dòng)子雙基因載體免疫組小鼠產(chǎn)生的抗體和細(xì)胞因子水平明顯高于其他四組,差

17、異顯著(P<0.01)。其中,順式雙啟動(dòng)子雙基因載體組高于反式雙啟動(dòng)子雙基因載體組,差異顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了漢坦病毒順式和反式雙啟動(dòng)子雙基因真核表達(dá)載體。
　　 2、與單啟動(dòng)子單基因載體相比,雙啟動(dòng)子雙基因載體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫效應(yīng)更好。
　　 3、與兩個(gè)單啟動(dòng)子單基因載體聯(lián)合免疫相比,單質(zhì)粒雙啟動(dòng)子雙基因載體引起的免疫效應(yīng)更好。
　　 4、與反