鴨腸炎病毒囊膜蛋白Gb和gC主要抗原域的原核表達(dá)和單克隆抗體的研制.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duckvirusenteritis，DVE)，是由鴨腸炎病毒(duckenteritisvirus，DEV)引起的鴨、鵝及天鵝等雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，其特點(diǎn)是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。鴨腸炎病毒屬于α-皰疹病毒科，gB和gC是其兩種重要的囊膜糖蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞過程中的受體識別和吸附過程中起重要作用。本研究將對DEVgB和gC主要抗原域的編碼區(qū)進(jìn)行了克隆

2、和原核表達(dá)，研制針對gB和gC的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究DEV的生物學(xué)特性和建立快速、準(zhǔn)確、特異的檢測方法奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究首先設(shè)計(jì)了5對針對gB和gC基因的特異性引物，采用PCR擴(kuò)增DEV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株DPV-F37的5個(gè)基因片段，將PCR產(chǎn)物純化后克隆到pGEX-6P1載體上，測序成功后分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收獲細(xì)菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和WesternBl

3、ot鑒定，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。重組蛋白均能與DEV特異性多抗血清反應(yīng)，說明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　 以超速離心純化的DEV作為免疫原，與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，免疫BALB/c小鼠，四免兩周后以純免疫原加強(qiáng)免疫，4d后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。以純化的重組蛋白gB和gC為包被原，建立篩選抗DEV-gB和抗DEV-gC蛋白單克隆抗體的間接ELISA方法，對篩選出的陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，

4、獲得7株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6F7、3G11、4B5、(1)A12、2H9、4D4和10A6，其中4B5和1A12為IgG2b，3G11和2H9為IgM，其余三株均為IgG1。雜交瘤細(xì)胞在體外經(jīng)15代連續(xù)傳代培養(yǎng)仍能持續(xù)、穩(wěn)定地分泌抗體。利用Westernblot實(shí)驗(yàn)對7株單抗識別的抗原肽段進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明10A6能與gB1反應(yīng)，1A12能與gB3反應(yīng)，6F7、3G11、4B5、2H9和4D4能與gC2反應(yīng)