鴨腸炎病毒單克隆抗體的制備及野毒株的分離鑒定.pdf

1、鴨腸炎病毒(DEV)鴨胚成纖維細胞適應(yīng)毒經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心法提純,免疫Balb/c小鼠,取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,經(jīng)間接ELISA方法篩選,有限稀釋法三次克隆,獲得兩株穩(wěn)定分泌DEV單克隆抗體的雜交瘤細胞株1B<,6>和2G<,8>,經(jīng)鑒定兩株單抗分別為IgM和IgG1亞類,腹水效價均達到1:10<'7>以上.利用細胞滴片技術(shù),以制備的單抗2G<,8>為基礎(chǔ),建立單抗介導(dǎo)的間接免疫熒光(IFA)檢測方法,并對DEV國

2、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)毒感染細胞進行動態(tài)間接IFA檢測,分別取感染后6、12、24、36、48、60h細胞進行檢測,均可見藍綠色熒光,以感染后48h熒光最為明顯.采用鴨胚成纖維細胞培養(yǎng)從山東和北京兩地暴發(fā)的鴨瘟臨床病例中分離到兩株DEV,分別命名為SD和BJ.對SD株感染細胞進行間接IFA檢測,可見明顯的藍綠色熒光,試驗感染7日齡雛鴨可引起鴨腸炎的典型臨床癥狀,死亡率為100﹪,取感染瀕死期鴨肝臟、胰臟、法氏囊和腦組織制備石蠟包埋切片,利用單抗2G<,

3、8>株進行免疫組化(IHC)檢測,除腦組織外均得到陽性結(jié)果.根據(jù)在GenBank上已發(fā)表的DEV兩段序列設(shè)計兩對引物,目的片段大小分別為765bp和1954bp.采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對野毒SD株和BJ株肝臟病料核酸提取物進行擴增,均得到預(yù)期大小的片段,將短片段PCR產(chǎn)物純化后直接測序,長片段克隆到Pmd18-T Vector后進行測序,對各毒株序列分別與發(fā)表序列進行比較,長片段和短片段不同毒株間的堿基序列同源性分別達到99.73