小反芻獸疫病毒N蛋白片段的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、小反芻獸疫(Peste Des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste Des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一種熱性、高度接觸性傳染病，是FAO/OIE規(guī)定的A類烈性傳染病，我國規(guī)定為一類動(dòng)物疫病。它主要感染小反芻動(dòng)物，特別是山羊，其高度易感，其他野生動(dòng)物也可偶爾發(fā)生。近期我國周邊國家大規(guī)模疫情的爆發(fā)以及2007年7月25日疫情在西藏自治區(qū)日土縣的首次發(fā)生，給我們敲響了

2、警鐘。
　　 N蛋白是病毒中含量最高的蛋白，抗原性最強(qiáng)，而且較為保守。Buckland等研究表明所有針對(duì)麻疹病毒屬病毒的N蛋白的單克隆抗體表位大多在Ⅳ區(qū)（421-525的羧基末端區(qū)）;另有研究表明小反芻獸疫病毒N蛋白的454～472位氨基酸序列具有非常強(qiáng)的免疫原性，而且是小反芻獸疫病毒特異的，這一區(qū)域的多肽抗體能特異地識(shí)別小反芻獸疫病毒。
　　 基于該背景，本研究根據(jù)已發(fā)表的小反芻獸疫病毒N蛋白的氨基酸序列，利用計(jì)算機(jī)軟

3、件從小反芻獸疫病毒N蛋白中篩選出與麻疹病毒屬其他成員具有較低同源性且含有強(qiáng)抗原決定簇的蛋白質(zhì)片段(376～525aa)并設(shè)計(jì)引物，以本中心保存的含小反芻獸疫病毒N蛋白基因的重組質(zhì)粒為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆小反芻獸疫病毒N蛋白片段（376-525aa）基因，大小為450bp。將PCR產(chǎn)物克隆到pET-28a表達(dá)載體。通過雙酶切及測序鑒定證實(shí)目的基因以正確的閱讀框架插入了pET-28a載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2

4、1(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物并用Western-blot進(jìn)行鑒定，目的片段獲得了正確表達(dá)，其分子量大約為21.5KD，與預(yù)期結(jié)果一致，且該重組蛋白能被小反芻獸疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。通過裂解細(xì)菌，溶解包涵體，利用載體上提供的His tag，使用Ni+離子親和層析柱從表達(dá)產(chǎn)物中純化目的蛋白，從而為小反芻獸疫病毒實(shí)驗(yàn)室診斷抗原和單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　 以純化

5、的重組小反芻獸疫病毒N蛋白片段(376～525aa)為免疫原免疫Balb/c小鼠，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并采用間接ELISA方法進(jìn)行篩選及3次亞克隆，共獲得了3株能穩(wěn)定分泌針對(duì)小反芻獸疫病毒N蛋白片段的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6G6、7C10和8C11，再通過小鼠體內(nèi)誘生法制得了腹水。其單抗亞類屬于IgG2b。經(jīng)Western-blot、間接ELISA試驗(yàn)鑒定，這3株單克隆抗體均能與重組小反芻獸疫病毒N蛋白片段