水稻4個OsVDAC蛋白的亞細胞定位和超表達osvdac3對水稻生長的影響.pdf

1、電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependentanionchannel,VDAC)蛋白,廣泛存在于從真菌到動植物的生物體中,依賴電壓調(diào)節(jié)其對陰陽離子的選擇性。研究表明,VDAC是由一個小的基因家族編碼,除了在線粒體外膜上存在外,在其它細胞組分中也存在具有VDAC結(jié)構(gòu)的蛋白。植物通常比哺乳動物具有更多的VDAC異構(gòu)體。
　　本實驗室前期通過生物信息學(xué)及表達分析,證實在水稻基因組中有8個vdac功能基因。和哺乳動物的3個vd

2、ac基因相比,水稻的8個vdac基因所編碼的蛋白的亞細胞定位、高級結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能尚不清楚。
　　本研究選取兩個在水稻花粉發(fā)育時期表達量較高的基因osvdac3和osvdac5,以及另外兩個vdac基因osvdac1和osvdac4為研究對象,對其進行了亞細胞定位的初步研究,并對過表達osvdac3的水稻植株的生長進行了初步研究。主要結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)osvdac3和osvdac5基因的ORF設(shè)計特異引物,將其分別克隆

3、到植物表達載體pCAMBIA1302-rfp,構(gòu)建了CaMV35S∷osvdac3∷rfp和CaMV35S∷osvdac5∷rfp過表達載體,以水稻YTB為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明,只有用CaMV35S∷osvdac3∷rfp的遺傳轉(zhuǎn)化獲得到了陽性轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因陽性植株中osvdac3基因表達量較野生型YTB及轉(zhuǎn)基因陰性植株均有不同程度的提高。表型觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株比陰性植株及野生型植株株高下降,

4、花粉育性也有不同程度的降低;對osvdac3基因超表達陽性家系T1代植株用NaCl和Mannitol協(xié)迫處理,其超表達陽性家系植株較陰性家系及野生型YTB植株的株高低、根長短。
　　2、根據(jù)osvdac1、osvdac3、osvdac4和osvdac5基因的ORF及osvdac3、osvdac5基因的C端和N端序列設(shè)計特異引物,擴增片段克隆到原生質(zhì)體瞬時表達載體pM999-gfp中,將其轉(zhuǎn)染水稻黃化苗提取的原生質(zhì)體瞬時表達,并進行

5、GFP和細胞器染料共定位分析。結(jié)果表明,OsVDAC1蛋白定位于細胞質(zhì);OsVDAC4蛋白定位于細胞質(zhì)及線粒體;OsVDAC3蛋白定位于除細胞核及線粒體外的細胞器。而OsVDAC3-C端、N端蛋白的定位結(jié)果表明,其也位于細胞質(zhì)及質(zhì)膜;OsVDAC5蛋白分布在細胞核的周圍,其綠色熒光的形狀有一定的折疊,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的構(gòu)象比較一致,推測其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而OsVDAC5-N端則位于細胞質(zhì)及質(zhì)膜。
　　3、利用實驗室已構(gòu)建的pET-30a