纖毛鵝觀草DREB類基因RcDREB1的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子，是造成我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)減產(chǎn)的主要因素。非生物抗逆性的研究由編碼某種特定產(chǎn)物的功能基因向信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控等開關(guān)基因克隆的方向發(fā)展。分離并轉(zhuǎn)移近緣野生植物抗逆的相關(guān)基因，使其能夠在轉(zhuǎn)基因植物中順利表達(dá)，以提高植物的抗逆性，這已發(fā)展成為改良植物抗性的新途徑。
　　 本文以纖毛鵝觀草為材料，依據(jù)AP2家族保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR和RACE技術(shù)

2、，克隆了一個(gè)響應(yīng)高鹽干旱的纖毛鵝觀草DREB類基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為RcDREB1。該基因全長(zhǎng)1171 bp，5'端有57 bp的非翻譯區(qū)，3'端具有完整的polyA尾。開放閱讀框長(zhǎng)為837 bp，無內(nèi)含子，編碼278個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，由60個(gè)氨基酸組成，第14位和19位為擷氨酸(V)和谷氨酸(E)。是AP2大家族的一個(gè)新成員。種系發(fā)生樹分析表明，RcDREB1與小麥AP2家族DREB類基因高度同源。氨基

3、酸序列相似性達(dá)到97％。構(gòu)建了pET30a-RcDREB1原核表達(dá)載體。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)表明，目標(biāo)基因RcDREB1在大腸桿菌中得到了大量表達(dá)。根據(jù)氨基酸序列推算，其蛋白分子量為30kD左右，加上表達(dá)載體pET30a中的標(biāo)簽蛋白S-Tag，表達(dá)的融合蛋白分子量約為34.6 kD左右。
　　 通過實(shí)時(shí)定量PCR分析了RcDREB1基因的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高鹽、干旱、重金屬鎘和低溫脅迫均可誘導(dǎo)RcDREB1表達(dá)，但其對(duì)高鹽反

4、應(yīng)較為顯著。
　　 構(gòu)建了真核表達(dá)載體pGAD-RcDREB1，通過酵母單雜交試驗(yàn)驗(yàn)證鵝觀草DREB蛋白的DNA結(jié)合域。將該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母菌株，在含10 mM3-AT的SD/Leu-，Ura-，His-平板上篩選轉(zhuǎn)化子，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明RcDREB1蛋白具有DNA結(jié)合域的功能，能夠特異結(jié)合DRE元件。
　　 為了進(jìn)一步分析克隆到的RcDREB1轉(zhuǎn)錄因子基因的功能，本研究同時(shí)構(gòu)建了以CaMV35S啟動(dòng)