豬TLR4基因的突變與功能分析.pdf

1、TLR4（Toll-like receptor4）是九十年代末發(fā)現(xiàn)的，是TLRs受體家族中的一員，屬于一型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)是富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-richrepeat，LRR）的N端。TLR4作為L(zhǎng)PS（存在于細(xì)胞壁外膜中的內(nèi)毒素成分，在革蘭陰性菌感染的致病機(jī)理中起著十分重要的作用）的最重要的模式識(shí)別受體.，是將LPS的刺激信號(hào)直接傳入細(xì)胞內(nèi)的一種跨膜信號(hào)受體，在介導(dǎo)革蘭氏陰性細(xì)菌及其LPs

2、的宿主反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR4作為L(zhǎng)PS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，通過(guò)MyD88蛋白與IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重合，最終導(dǎo)致NF-κB的激活，引起各種炎癥因子基因表達(dá)。由于TLR4基因?yàn)槊庖呦嚓P(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)將其作為豬抗病育種的候選基因進(jìn)行研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要研究豬TLR4基因的多態(tài)性及功能，利用PCR-SSCP方法檢測(cè)TLR4基因在野豬、民豬、北京黑豬、長(zhǎng)白、大白和杜洛克六個(gè)豬（品）種中的多態(tài)性，探討不同基因型在不同品系（種）間的分布

3、規(guī)律；構(gòu)建野生型和突變型真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞，用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞；用熒光素酶檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)通路NF-κB活性；得用Real-time PCR方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)前后細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)量。主要研究結(jié)果如下：
　　 1利用PCR-SSCP方法在TLR4基因外顯子3和3’UTR上共尋找到5個(gè)單核苷酸突變，其中有3個(gè)突變屬于錯(cuò)義突變。群體遺傳學(xué)分析表明，所檢測(cè)的5個(gè)位點(diǎn)中，6個(gè)品種間基因型的分布均存在著極顯著的差異（P<

4、0.01）。
　　 2成功將TLR4基因CDS611bp處進(jìn)行定點(diǎn)突變，并構(gòu)建了野生型和突變型pcDNA3.1+-TLR4真核表達(dá)載體。
　　 3將表達(dá)載體、pNF-κB熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶質(zhì)粒以10:10:1的量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）24h，后用1μg/ml的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞12h后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性最高（P<0.05）。
　　 4熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果為，過(guò)表達(dá)野生型與突變型TLR4相比，未誘導(dǎo)

5、LPS組兩者之間NF-κB活性存在顯著差異（P<0.05）；而誘導(dǎo)LPS組兩者之間有極顯著差異（P<0.01）。過(guò)表達(dá)野生型TLR4可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性，而過(guò)表達(dá)突變型TLR4對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性無(wú)明顯影響。
　　 5過(guò)表達(dá)野生型與突變型TLR4相比，未誘導(dǎo)LPS組兩者之間在轉(zhuǎn)錄水平的IL-6表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05）：而誘導(dǎo)LPS組兩者之間有極顯著差異（P<0.01）。過(guò)表達(dá)野生型TLR4可促進(jìn)LP