TLR-RIG信號(hào)通路相關(guān)基因克隆與功能研究.pdf

1、本文立足于TLR、RIG干擾素信號(hào)通路,研究了該信號(hào)通路中有關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,以及它們在病毒刺激中的應(yīng)答,同時(shí),本文還選取了SKIV(Spottedknife iridovirus)病毒的一個(gè)基因-FLP(Ftsk Like Protein),作為研究該病毒致病、染色體復(fù)制與包裝的出發(fā)點(diǎn)。
　　 (1)在TLR信號(hào)通路中,IRF5/7(Interferon Regulatory Factor5/7)在其中具有重要的意義,通過生

2、物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)斑馬魚的IRF7蛋白與人類IRF7蛋白的同源度很低,通過RACE技術(shù),對(duì)斑馬魚zfIRF5/7二個(gè)基因進(jìn)行了克隆。zfIRF7編碼423個(gè)氨基酸,QRT-PCR表明其mRNA表達(dá)在腦,心臟含量比較高,而zfIRF5編碼297個(gè)氨基酸,組織表達(dá)具有廣譜性,這2個(gè)基因在胚胎發(fā)育6hpi時(shí)mRNA相對(duì)含量較高,隨著胚胎的發(fā)育成熟而慢慢降低,最后趨于穩(wěn)定。將zfIRF7的熒光表達(dá)載體進(jìn)行斑馬魚胚胎顯微注射實(shí)驗(yàn),沒有發(fā)現(xiàn)斑馬魚在

3、胚胎發(fā)育中有畸形。zfIRF5繼哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的9種IRF5剪接體后的又一種新發(fā)現(xiàn)的IRF5剪接體分子,它作為zfIRF5全長的一部分,只具有N端的IRF結(jié)構(gòu)域,而缺失C端IRF3結(jié)構(gòu)域。在L8G5-LUC熒光素酶報(bào)告基因活性分析實(shí)驗(yàn)中,zfIRF5與zfIRF7一樣可以激活基因的轉(zhuǎn)錄,而且C端比全長還要強(qiáng)1.5倍。IRF5/7可以激活I(lǐng)SRE信號(hào)通路,但是IRF7可以激活I(lǐng)NF-β信號(hào)通路而zfIRF5沒影響,同時(shí)zfIRF7在I

4、SRE,INF-β的這種激活活性可以被zfIRF5所抑制。在熒光共定位實(shí)驗(yàn)中,zfIRF7可以促進(jìn)zfIRF5定位在細(xì)胞核,為IRF5蛋白的入核提供了一個(gè)全新的佐證。通過CO-IP實(shí)驗(yàn),確定zfIRF5可以與zfIRF7相互作用。斑馬魚在POLY(I:C)、LPS的刺激后,zfIRF7基因在12小時(shí)表達(dá)開始上升,但是zfIRF5對(duì)此并不敏感。ISKNV(Infectious spleen and kidney necrosis viru

5、s)感染斑馬魚后、zfIRF7在感染48后表達(dá)開始急劇上升,zfIRF5的變化不明顯。誘導(dǎo)表達(dá)和純化了zfIRF5/7的融合蛋白,并獲得了相應(yīng)的兔源多克隆抗體,為將來的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 (2)MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein)是RIG信號(hào)通路中重要蛋白,在NCBI河鲀的數(shù)據(jù)庫中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)類似MAVS的蛋白的分子,利用已知的染色體DNA片段序列,對(duì)該基因進(jìn)

6、行了5'、3'RACE,得到了2630bp的該基因全長序列,其ORF全長1656bp,編碼551個(gè)氨基酸,利用該ORF片段,構(gòu)建了系列載體,對(duì)它們進(jìn)行了系列的功能研究。在生物信息學(xué)分析表明,MAVS-like含有一個(gè)CARD、一個(gè)PRO-rich、三個(gè)GLA-rich和一個(gè)TM跨膜結(jié)構(gòu)域,這些特征是已知的MAVS所相似的。我們對(duì)河純MAVS-like基因的組織分布做了定量分析,MAVS-like在肝臟,肌肉中含量很高。利用LPS、PGN

7、、poly(I:C)對(duì)河純進(jìn)行刺激時(shí),發(fā)現(xiàn)MAVS-like的mRNA水平對(duì)LPS、PGN的刺激不敏感,在poly(I:C)的刺激下急劇下降,當(dāng)ISKNV感染河鲀時(shí),MAVS—like的mRNA水平也下調(diào)。通過ISRE,NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn),表明MAVS-like可以激活這兩條信號(hào)通路,MAVS-like缺失PRO-RICH domain后,信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng),當(dāng)該基因缺少TM區(qū)域時(shí),則抑制信號(hào)的傳導(dǎo)的:在熒光定位實(shí)驗(yàn)中,MA

8、VS-like無法定位在線粒體,而是定位在細(xì)胞膜的附近,這與編碼ORF的第1,2和4號(hào)外顯子有關(guān)系,當(dāng)1,2號(hào)外顯子一起缺少,或者4號(hào)外顯子缺失,該突變體都不象全長一樣定位在細(xì)胞膜附近,但是缺失TM區(qū)域,對(duì)細(xì)胞的定位沒有明顯的影響。在實(shí)驗(yàn)中,PRO-rich缺失的GFP融合蛋白在細(xì)胞中形成明亮的點(diǎn)狀,而PRO-rich domain可以阻止這種明亮GFP點(diǎn)的形成。通過CO-IP實(shí)驗(yàn),證明MAVS-like與zfTRAF3可以相互作用；利

9、用原核表達(dá)系統(tǒng),得到MAVS-like的兔多抗。利用真核、原核表達(dá)蛋白,通過Far-Western Blot實(shí)驗(yàn),確認(rèn)MAVS-like的CARD domain可以相互作用。
　　 (3)SKIV是感染魚類的一種重要的病毒,通過生物信息學(xué)分析表明該病毒的FLP(Ftsk Like Protein)基因,可能參與了病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,宿主的信號(hào)傳導(dǎo)以及病毒本身染色體的復(fù)制,病毒包裝與成熟等機(jī)制,因此,我們克隆了該基因,并構(gòu)建了一系

10、列的載體。FLP由3762個(gè)堿基編碼1253個(gè)氨基酸,是SKIV,也可能是虹彩病毒中分子量最大的一個(gè)蛋白。FLP含有一個(gè)SAP,一個(gè)FtsK和一個(gè)Glu domain,SAPdomain只在真核生物中有發(fā)現(xiàn),FtsK domain則一般發(fā)現(xiàn)在原核生物中,而Gludomain則在原核,真核中都有發(fā)現(xiàn),SKIV中發(fā)現(xiàn)的這個(gè)基因,可能具有這3種domain,將真核,原核,病毒各進(jìn)化層次的物種所具有的domain融合在一起。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明該基

11、因全長部分入核,分別包含有上敘3種domain的片段都完全入核,因此可以推斷它最少具有3個(gè)NLS,因此,它入核信號(hào)的調(diào)節(jié)信號(hào)應(yīng)該是很復(fù)雜的。實(shí)驗(yàn)表明該蛋白是一個(gè)抑制型轉(zhuǎn)錄因子,抑制宿主的NF-κB,INF-β信號(hào)通路,甚至還可以抑制宿主的Glu酶的活性。QRT-PCR表明,它在MCP的表達(dá)之后,所以該基因是一個(gè)晚期表達(dá)基因。
　　 此外,構(gòu)建了FLP-RNAi載體,可以為后期的工作作準(zhǔn)備,同時(shí),鑒定了FtsK domain不定位